DB15 T 2028-2020 绵羊和山羊源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法.pdf

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1、ICS 07.080 CCS A 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2028 2020 绵羊和山羊源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR Method for Authentification of Sheep and Goat Derived Materials 2020-10-20 发布 2020-11-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2028 2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起 草。 本文件由锡林郭勒职业学

2、院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心提出。 本文件由内蒙古自治区肉乳标准化技术委员会（ SAM/TC 39）归口。 本文件起草单位：锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心、中国农业科学 院农业质量标准与检测 技术研究所。 本文件主要起草人： 郭梁、刘国强、于园、赵燕、徐伟良、罗建兴、李春冬、张娟 。 DB15/T 2028 2020 1 绵羊和山羊源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件描述了动物产品（肉、乳）中绵羊和山羊源性成分的实时荧光 PCR检测方法。 本文件适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品中绵羊和山羊源性成分的定性检测。 2 规范性引

3、用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR real time PCR 在 PCR反应体系中加入 荧光 基团，利用荧光信号 的 积累实时 检测 整个 PCR过程，对未知模板进行定性 或定量分析。 3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧

4、光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.3 阳性对照 positive control 用已知含有绵羊和山羊源性成分的样品作阳性对照。 3.4 阴性对照 negative control 用已知不含有绵羊和山羊 源性成分的样品 作阴性对照 。 3.5 DB15/T 2028 2020 2 空白对照 blank control 用等体积的灭菌水代替模板 DNA作空白对照。 4 原理 利用不同荧光基团标记特异性绵羊和山羊探针以及质控探针， 采用 多重 实时荧光 PCR技术， 对提取 于 鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品 的 DNA进行扩增。在同一反应中对绵羊和山羊特异基因以及质 控基因同时扩增

5、，三种荧光同时检测。其中，同管质控探针的检测旨在监控扩增反应是否正常进行，避 免假阴性结果。通过评价 Ct值判断动物产品（肉、乳）是否含有绵羊 和山羊源性成分。 5 试剂和材料 除另有 规定外 ， 所有试剂均为 分析纯 。实验用水为 符合 GB/T 6682规定的一级水。 5.1 三氯甲烷。 5.2 异戊醇。 5.3 异丙醇。 5.4 95%乙醇 。 5.5 75%乙醇 。 5.6 CTAB 提取液 ：称取 10 g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、 40.6 g NaCl、 6.06 g Tris base（三 羟甲基氨基甲烷）、 3.94 g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠） ，加入

6、800 mL 的水，在 65 水浴加热溶解， 用 HCl 调节 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL， 在 121 条件下，灭菌 30 min。 使用前加入终 浓度为 2% 的 -巯基乙醇。 5.7 乳化剂：量取 20 mL Triton X-100（ 聚乙二醇辛基苯基醚， 90%）、 125 mL 乙醇（ 95%） 、 855 mL NaCl 溶液 （ 0.9 g/L），加水定容至 1000 mL， 在 121 条件下，灭菌 30 min。 5.8 PBS 缓冲液（磷酸缓冲液） ：称取 8 g NaCl、 0.2 g KCl、 1.44 g Na2HPO4、 0.24 g KH2PO

7、4， 加入 800 mL 水溶解，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1000 mL， 在 121 条件下，灭菌 30 min。 5.9 实时荧光 PCR 反应 混 合液： 1 U 2 U 的 Taq 酶、 1 PCR 缓冲液、 2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg2+、 0.2 U 1 U 的 UNG 酶、 0.2 mmol/L 的 dNTP。也可以使用同等效果的商品试剂盒。 5.10 绵羊和山羊 源性成分扩增引物和探针详见表 1。 表 1 引物和探针序列 名称 序列（ 5 3 ） 目标基因 /大小 正向引物 TTGAATYAGGCCATGAAGC 线粒体 12S

8、 rRNA 基因 绵羊 120 bp 山羊 120 bp 反向引物 CTTACCTTGTTACGACTTRTCTC 绵羊 特异性探针 FAM-CCTCTCGTGTGGTTGATATATGTAAATAGGTT-TAMRA 山羊 特异性探针 HEX-TCTCATGTAGTTGATGCGTGTTAATAGGCT-TAMRA 质控探针 ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2 DB15/T 2028 2020 3 表 1 （续） 名称 序列（ 5 3 ） 目标基因 /大小 注： 用 灭菌水 分别将上述引物和探针稀释到 10 mol/L，探针需避光保存 ，序列中 Y 代表 T/C，序列

9、中 R 代表 G/A。 6 仪器和设备 6.1 实 时荧光 PCR 仪 ：通道数 3，温度控制精度 0.1 。 6.2 核酸蛋 白 分析 仪 或紫外分光光度计。 6.3 离心机：离心力 12000 g。 6.4 微量移液器： 0.5 L 10 L， 10 L 100 L， 20 L 200 L， 100 L 1000 L。 6.5 金属浴或恒温水浴锅 ：温度控制精度 0.5 。 6.6 pH 计 ： 0.01 级 。 6.7 均质器 。 6.8 搅拌 器 。 6.9 分析天平：感量 0.1 g 和 0.0001 g。 6.10 高压灭菌锅 。 6.11 旋涡混匀器。 7 分析步骤 7.1 样品

10、制备 利用均质器将固态样品 充分混匀，装入清洁容器中，加封后， 注明 标记。 利用搅拌器将液态样品充 分 混匀，装入清洁容器中，加封后， 注明 标记。 -20 保存 。 7.2 DNA 提取 7.2.1 鲜肉及肉乳制品样品（固态） 称 取 100 mg均质固态样品于 1.5 mL灭菌离心管中；加入 700 L CTAB提取液（ 5.6） ， 充分 混匀， 置于 65 水浴 30 min， 期间每隔 5 min颠倒混匀一次； 13000 rpm离心 5 min，转移上清液于 新 离心管中， 加入等体积三氯甲烷 和 异戊醇混合液 （体积比为 24:1） ， 旋涡 混匀， 13000 rpm离心 5

11、 min，取上清液于 新 离心管中 ， 加入等体积的异丙醇，充分混匀， 13000 rpm离心 5 min，弃去上清液， 75%乙醇洗涤 两 次 （ 13000 rpm离心 30 s弃 去上清液 ） ， 室温 晾干，加入 20 L 50 L灭菌水溶解 ， -20 保存。对阳性 对照和阴性对照进行同法操作。用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空白对照。也可以使用同等效 果的 DNA提取试剂盒。 7.2.2 鲜乳及乳制品样品（液态） DB15/T 2028 2020 4 量取 50 mL均质液态样品于 50 mL灭菌离心管中； 在 4 ， 7500 rpm条件下，离心 30 min， 去除离心 管

12、上层乳脂和中间层的液体，保留底部沉淀； 向离心管 中 加入 600 L PBS缓冲液（ 5.8） ， 将沉淀悬浮 并全部转移至 1.5 mL灭菌离心管中，在 4 ， 13000 rpm条件下， 离心 10 min，弃去上层液体，保留底 部沉淀 ； 向 离心管中 加 入 60 L乳化剂 （ 5.7） 和 540 L PBS缓冲液（ 5.8） ，振荡至沉淀完全悬浮， 置 于 40 恒温水浴 10 min，在 4 ， 13000 rpm条件下， 离心 10 min，弃 去 上清液保留底部沉淀 ； 加 入 500 L PBS缓冲液（ 5.8） 悬浮沉淀， 在 4 ， 13000 rpm条件下， 离心

13、10 min， 弃 去 上清液保留底部沉淀 ； 后续提取步骤按照 7.2.1方法进行。用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空白对照。也可以使用同 等效果的 DNA提取试 剂盒。 7.2.3 DNA 浓度和纯度的测定 分别检测 260 nm和 280 nm处的吸光值 A260和 A280，按公式（ 1）计算 DNA浓度，判定 DNA的纯度。当 DNA 浓度在 10 ng/L 100 ng/L， A260/A280比值在 1.7 2.1之间时，适合 实时荧光 PCR反应 。 若浓度大于 100 ng/L时，建议用灭菌水稀释；若浓度小于 10 ng/L或比值小于 1.7时，建议重新进行 DNA提取。

14、 c = A N 50/1000 （ 1） 式中： c DNA浓度，单位为微克每微 升（ g/L）； A 260 nm处的吸光值； N 核酸稀释倍数。 7.3 实时荧光 PCR 检测 7.3.1 实时荧光 PCR 反应体系 设置阳性对照 、 阴性对照 、 空白对照 以及提取空白对照 。所有样品设置平行 反应 。实时荧光 PCR反 应体系 见 表 2。 表 2 实时荧 光 PCR 反应体 系 单位为微升 试剂 体积 2 实时荧光 PCR 反应混合液 10.0 正向引物 （ 10 mol/L） 1.0 反向引物 （ 10 mol/L） 1.0 绵羊 特异性探针 （ 10 mol/L） 0.5 山羊

15、 特异性探针 （ 10 mol/L） 0.5 质控探 针 （ 10 mol/L） 0.5 DNA 模板 （ 10 ng/L 100 ng/L） 1.0 灭菌水 5.5 总体积 20.0 注： 反应体系 根据不同厂家的商品试剂盒或不同型号的实时荧光 PCR 仪进行调整。 7.3.2 实时荧光 PCR 反应程序 预变性： 94 30 s， 1个循环； 94 5 s， 60 31 s， 40个循环，在 60 时收集荧光信号 。 反应程序 根据不同厂家的商品试剂盒或不同型号的实时荧光 PCR仪进行调整 。 DB15/T 2028 2020 5 8 质量控制 以下条件有一条不满足时，试验视为无效： a)

16、 空白对照：所有探针无荧光对数 增长或 Ct 值 40.0； b) 阴性对照：特异性探针无荧光对数增长或 Ct 值 40.0；质控探针有荧光对数增长， Ct 值 30.0； c) 阳性对照：特异性探针和质控探针均有荧光对数增长，且出现典型的扩增曲线， Ct 值 30.0； d) 平行 反应 结果不一致，需要重新扩增。 9 结果判定与表述 9.1 结果判定 在符合第 8章的情况下： a) 特异性探针 Ct 值 35.0 且质控探针 Ct 值 35.0，则判定为阳性 ； b) 特异性探针 Ct 值 40.0 且质控探针 Ct 值 35.0，则判定为阴性 ； c) 特异性探针 35.0 Ct 值 4

17、0.0 且质控探针 Ct 值 35 .0，则需要重 复实验 ； 如再次扩增后特 异性探针 Ct 值仍 40.0，则判定为阳性；如再次扩增后特异性探针 Ct 值 40 .0，则判定为阴 性 。 9.2 结果表述 9.2.1 样品阳性，表述为 “ 检出 绵羊或 /和山羊 源性成分 ” 。 9.2.2 样品阴性，表述为 “ 未检出 绵羊或 /和山羊 源性成分 ” 。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T 27403中附录 D的规定执行。 DB15/T 2028 2020 6 A A 附 录 A （资料性） 目的基因扩增靶标参考序列 A.1 绵羊特异性基因实时荧光 PCR扩增产物核苷 酸

18、序列（ 120 bp）及引物和探针位置 TTGAATCAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGTAAATATGATATACTTAAACCTATTTACATATATCA ACCACACGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAG 注： 单 下划线部分为正向引物和反向引物序列，双下划线部分为质控探针序列，虚线部分为 绵羊特异性探针 序列。 A.2 山羊特异性基因实时荧光 PCR扩增产物核苷酸序 列（ 120 bp） 及引物和探针位置 TTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGTAAATACAATGCACTCAAGCCTATTAACACGCATCA ACTACATGAGAGGAGATAAGTCGTAACAAGGTAAG 注： 单 下划线部分为正向引物和反向引物序列，双下划线部分为质控探针序列，虚线部分为 山羊特异性探针 序列。