DB22 T 3111-2020 猫杯状病毒检测 实时荧光RT-PCR法.pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 31112020 猫杯状病毒检测 实时荧光 RT-PCR 法 Detection method of real time quantitative RT-PCR for Feline calicivirus 2020 - 03 - 16 发布 2020 - 03 - 30 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 31112020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB /T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位:吉林农业大学、吉林
2、省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人:胡桂学、王开、郭衍冰、姜雪、黄海龙、呼延含蓉、赵艳丽、程荣华、伊淑帅、 牛江婷。 DB22/T 31112020 1 猫杯状病毒检测 实时荧光 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了猫杯状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、结 果判定和废弃物处理的技术要求。 本标准适用于猫杯状病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试
3、验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct 循环阈值 (Cycle threshold) Cdna 互补脱氧核糖核酸 (Complementar y Deoxyribonucleic acid) DMEM 改良Eagle培养基 (Dulbeccos modification of Eagles medium) ORF 开放阅读框 (Open Reading Frame) RNA 核糖核酸 (Ribonucleic acid) RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 (Reverse transc
4、 ription polymerase chain reaction) 4 原理 根据猫杯状病毒衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列,设计引物和探针。探针在5端标记FAM荧光素作 为报告荧光基团,3端标记Eclipse作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的 基因片段结合,此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;反应 进入延伸阶段时,Taq酶发挥53的外切核 酸酶功能,将探针降解。探针上的荧光基团游离出来, 所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复,PCR产物呈指数形式 增长,荧光信号也相应增长。每个模板的Ct值与
5、该模板起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越 多,Ct值越小。 5 试剂和材料 5.1 试剂 DB22/T 31112020 2 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 5.1.1 DMEM 培养液。 5.1.2 液氮。 5.1.3 RNA 提取试剂盒。 5.1.4 反转录试剂盒。 5.1.5 阳性对照,为猫杯状病毒的细胞培养物或非感染性体外转录 RNA。 5.1.6 阴性对照,为不含猫杯状病毒的细胞培养液。 5.1.7 无 RNA 酶的水(Rnase free water)。 5.1.8 Taq 酶。 5.2 材料 5.2.1 无菌
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