DB15 T 2022-2020 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法.pdf

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1、ICS 07.080 CCS A 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2022 2020 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR Method for Authentification of Cattle and Horse Derived Materials 2020-10-20 发布 2020-11-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2022 2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起 草。 本 文件 由 锡林郭勒

2、职业学院、 锡林郭勒食品 药品 检验检测和风险评估中心提出。 本 文件 由内蒙古自治区肉乳标准化 技术 委员会 （ SAM/TC 39） 归口。 本 文件 起草单位： 锡林郭勒职业学院、 锡林郭勒食品 药品 检验检测和风险评估中心。 本 文件 主要起草人： 郭梁、罗建兴、徐伟良、其勒木格、郭元 晟、李春冬、刘国强。 DB15/T 2022 2020 1 牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件描述了动物产品（肉、乳）中牛和马源性成分的实时荧光 PCR检测方法。 本文件适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品中牛和马源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的

3、内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质 量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR real time PCR 在 PCR反应体系中加入 荧光 基团，利用荧光信号 的 积累实时 检测 整个 PCR过程，对未知模板进行 定性或定量分析。 3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值

4、时所经历的循环数。 3.3 阳性对照 positive control 用已知含有牛和马源性成分的样品作阳性对照。 3.4 阴性对照 negative control 用已知 不 含有 牛和马源性成分的样品 作阴性对照 。 DB15/T 2022 2020 2 3.5 空白对照 blank control 用等体积的灭菌水代替模板 DNA作空白对照 。 4 原理 利用不同荧光基团标记特异性牛和马探针以及质控探针， 采用 多重 实时荧光 PCR技术， 对提取于 鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品 的 DNA进行扩增。在同一反应中对牛和马特异基因以及质控基 因同时扩增，三种荧光同时检测。其中，同管

5、质控探针的检测旨在监控扩增反应是否正常进行，避 免假阴性结果。通过评价 Ct值判断 动物产品（肉、乳） 是否含有牛和马源性成分。 5 试剂和材料 除另有 规定外 ， 所有试剂均为 分析纯 。实验用水为 符合 GB/T 6682规定的一级水。 5.1 三氯甲烷。 5.2 异戊醇。 5.3 异丙醇。 5.4 95%乙醇 。 5.5 75%乙醇 。 5.6 CTAB 提取液 ：称取 10 g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、 40.6 g NaCl、 6.06 g Tris base （三羟甲基氨基甲烷）、 3.94 g Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠） ，加入 800 mL 的水，在 65 水

6、浴 加热溶解，用 HCl 调节 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL， 在 121 条件下，灭菌 30 min。 使用前加 入终浓度为 2%的 -巯基乙醇。 5.7 乳化剂：量取 20 mL Triton X-100（ 聚乙二醇辛基苯基 醚， 90%）、 125 mL 乙醇（ 95%） 、 855 mL NaCl 溶液 （ 0.9 g/L），加水定容至 1000 mL， 在 121 条件下，灭菌 30 min。 5.8 PBS 缓冲液（磷酸缓冲液） ：称取 8 g NaCl、 0.2 g KCl、 1.44 g Na2HPO4、 0.24 g KH2PO4， 加 入 800 mL 水溶

7、解，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水定容至 1000 mL， 在 121 条件下，灭菌 30 min。 5.9 实时荧光 PCR 反应 混合液： 1 U 2 U 的 Taq 酶、 1 PCR 缓冲液、 2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg2+、 0.2 U 1 U 的 UNG 酶、 0.2 mmol/L 的 dNTP。也可以使用同等效果的商品试剂盒。 5.10 牛和马 源性成分扩增引物和探针详见表 1。 表 1 引物和探针序列 名称 序列（ 5 3 ） 目标基因 /大小 正向引物 TTGAATYAGGCCATGAAGC 线粒体 12S rRNA 基因 牛 120 bp

8、马 121 bp 反向引物 CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC 牛 特异性探针 FAM-CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG-TAMRA DB15/T 2022 2020 3 表 1 引物和探针序列 （续） 名称 序列（ 5 3 ） 目标基因 /大小 马 特异性探针 HEX-TTCATATGTTTGGGTCACGGTTTTATGT-TAMRA 质控探针 ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2 注： 用 灭菌水 分别将上述引物和探针稀释到 10 mol/L，探针需避光保存 ，序列中 Y 代表 T/C。 6 仪器和设备 6.1 实 时荧光 P

9、CR 仪 ：通道数 3，温度控制精度 0.1 。 6.2 核酸蛋白 分析 仪 或紫外分光光度计。 6.3 离心机：离心力 12000 g。 6.4 微量移液器： 0.5 L 10 L， 10 L 100 L， 20 L 200 L， 100 L 1000 L。 6.5 金属浴或恒温水浴锅 ：温度控制精度 0.5 。 6.6 pH 计 ： 0.01 级 。 6.7 均质器 。 6.8 搅拌 器 。 6.9 分析天平：感量 0.1 g 和 0.0001 g。 6.10 高压灭菌锅 。 6.11 旋涡混匀器。 7 分析步骤 7.1 样品制备 利用均质器将固态样品 充分混匀，装入清洁容器中，加封后，

10、注明 标记。 利用搅拌器将液态样 品充分 混匀，装入清洁容器中，加封后， 注明 标记。 -20 保存 。 7.2 DNA 提取 7.2.1 鲜肉及肉乳制品样品（固态） 称 取 100 mg均质固态样品于 1.5 mL灭菌离心管中；加入 700 L CTAB提取液（ 5.6） ， 充分 混匀， 置于 65 水浴 30 min， 期间每隔 5 min颠倒混匀一次； 13000 rpm离心 5 min，转移上清液于 新 离心 管中，加入等体积三氯甲烷 和 异戊醇混合液 （体积比为 24:1） ， 旋涡 混匀， 13000 rpm离心 5 min， 取上清液于 新 离心管中 ， 加入等体积的异丙醇，充

11、分混匀， 13000 rpm离心 5 min，弃去上清液， 75% 乙醇洗涤 两 次 （ 13000 rpm离心 30 s弃 去上清液 ） ， 室温 晾干，加入 20 L 50 L灭菌水溶解 ， -20 保存。对阳性对照和阴性对照进行同法操作。 用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空白对照。 也可以使用同等效果的 DNA提取试剂盒。 DB15/T 2022 2020 4 7.2.2 鲜乳及乳制品样品（液态） 量取 50 mL均质液态样品于 50 mL灭菌离心管中； 在 4 ， 7500 rpm条件下，离心 30 min， 去除 离心管上层乳脂和中间层的液体，保留底部沉淀； 向离心管 中 加入

12、600 L PBS缓冲液（ 5.8） ， 将沉 淀悬浮并全部转移至 1.5 mL灭菌离心管中，在 4 ， 13000 rpm条件下， 离心 10 min，弃去上层液体， 保留底部沉淀 ； 向 离心管中 加 入 60 L乳化剂 （ 5.7） 和 540 L PBS缓冲 液（ 5.8） ，振荡至沉淀完全 悬浮， 置于 40 恒温水浴 10 min，在 4 ， 13000 rpm条件下， 离心 10 min，弃 去 上清液保留底部 沉淀 ； 加 入 500 L PBS缓冲液（ 5.8） 悬浮沉淀， 在 4 ， 13000 rpm条件下， 离心 10 min， 弃 去 上 清液保留底部沉淀 ；后续提取

13、步骤按照 7.2.1方法进行。用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空 白对照。 也可以使用同等效果的 DNA提取试剂盒。 7.2.3 DNA 浓度和纯度的测定 分别检测 260 nm和 280 nm处的吸光值 A260和 A280，按公式（ 1）计算 DNA浓度， 判定 DNA的纯度。当 DNA浓度在 10 ng/L 100 ng/L， A260/A280比值在 1.7 2.1之间时，适合 实时荧光 PCR反应 。 若浓度 大于 100 ng/L时，建议用灭菌水稀释；若浓度小于 10 ng/L或比值小于 1.7时，建议重新进行 DNA 提取。 c = A N 50/1000 （ 1） 式中：

14、c DNA浓度，单位为微克每微升（ g/L）； A 260 nm处的吸光值； N 核酸稀释倍数。 7.3 实时荧光 PCR 检测 7.3.1 实时荧光 PCR 反应体系 设置阳 性对照 、 阴性对照 、 空白对照 以及提取空白对照 。所有样品设置平行 反应 。实时荧光 PCR 反应体系 见 表 2。 表 2 实时荧光 PCR 反应体系 单位为微升 试剂 体积 2 实时荧光 PCR 反应混合液 10.0 正向引物 （ 10 mol/L） 1.0 反向引物 （ 10 mol/L） 1.0 牛 特异性探针 （ 10 mol/L） 0.5 马 特异性探针 （ 10 mol/L） 0.5 质控探针 （

15、10 mol/L） 0.5 DNA 模板 （ 10 ng/L 100 ng/L） 1.0 灭菌水 5.5 总体积 20.0 注： 反应体系 根据不同厂家的商品试剂盒或不同型号的实时荧光 PCR 仪进行调整。 DB15/T 2022 2020 5 7.3.2 实时荧光 PCR 反应程序 预变性： 94 30 s， 1个循环； 94 5 s， 60 31 s， 40个循环，在 60 时收集荧光信号 。 反应程序 根据不同厂家的商品试剂盒或不同型号的实时荧光 PCR仪进行调整。 8 质量控制 以下条件有一条不满足时，试验视为无效： a) 空白对照：所有探针无荧光对数增长或 Ct 值 40.0； b)

16、 阴性对照：特异性探针无荧光对数增长或 Ct 值 40.0；质控探针有荧光对数增长， Ct 值 30.0； c) 阳性 对照：特异性探针和质控探针均有荧光对数增长，且出现典型的扩增曲线， Ct值 30.0； d) 平行 反应 结果不一致，需要重新扩增。 9 结果判定与表述 9.1 结果判定 在符合第 8章的情况下： a) 特异性探针 Ct 值 35.0 且质控探针 Ct 值 35.0，则判定为阳性 ； b) 特异性探针 Ct 值 40.0 且质控探针 Ct 值 35.0，则判定为阴性 ； c) 特异性探针 35.0 Ct 值 40.0 且质控探针 Ct 值 35 .0，则需要重复实验 ； 如再

17、次扩增后 特异性探针 Ct 值仍 40.0，则判定为阳性；如再次扩增后特异性探针 Ct 值 40 .0， 则判 定为阴性 。 9.2 结果表述 9.2.1 样品阳性， 表述为 “ 检出 牛或 /和马 源性成分 ” 。 9.2.2 样品阴性，表述为 “ 未检出 牛或 /和马 源性成分 ” 。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T 27403中附录 D的规定执行 。 DB15/T 2022 2020 6 A A 附 录 A （资料性） 目的基因扩增靶标参考序列 A.1 牛特异性基因实时荧光 PCR扩增产物核苷酸序列（ 120 bp）及引物和探针位置 TTGAATTAGGCCATGAA

18、GCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCA CTAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAG 注： 单下划线部分为正向引物和反向引物序列，双下划线部分为质控探针序列，虚线部分为牛特异性探针序列。 A.2 马特异性基因实时荧光 PCR扩增产物核苷酸序列（ 121 bp）及引物和探针位置 TTGAATCAGGCCATGAAGCGCGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTTAAATATCACAAATCACAACATAACATAAAACCGTGA CCCAAACATATGAAAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAG 注： 单下划线部分为正向引物和反向引物序列，双下划线部分为质控 探针序列，虚线部分为马特异性探针序列。