DB32 T 3925-2020 白斑综合征病 (WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范.pdf

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1、 i ICS 65.150 B 52 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 3925 2020 白斑综合征病毒 (WSSV)环介导等温扩增 (LAMP)检测 技术 规范 Technical specification of detecting white-spot syndrome virus (WSSV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 2020 -12- 15 发布 2021 -01- 15 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3925 2020 I 前 言 本 文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作到

2、则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草 。 本 文件 的附录 A、 B为资料性附录。 本 文件 由 苏州大学 提出并 归口 。 本 文件 起草单位：苏州大学、 江苏省水生动物疫病预防控制中心 本 文件 主要起草人： 薛仁宇、贡成良、陈辉、曹广力、魏育红、方苹、胡小龙、朱敏、刘波 。 DB32/T 3925 2020 1 白斑综合征病毒 (WSSV)环介导等温扩增 (LAMP)检测技术规范 1 范围 本 文件 规定了用 LAMP技术检测白斑综合征病毒的方法。 本 文件 适用于 环介导等温扩增 (LAMP)对虾、蟹 白斑综合征病毒的鉴定 及其 检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中

3、的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条 款。其中，注日期的引用文件， 仅改日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103 2008 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语 和 定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 环介导等温扩增 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 一种新的等温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异性引物，利用一种链置 换 DNA 聚合酶在等 温条件下保温 30

4、min-60min， 所 完成的核酸扩增反应。 4 试剂和材料 4.1 水 应 符合 GB/T 6682 中一级水的 要求。 4.2 模板制备缓冲液 缓冲液中含 20 mM Tris-HCl， 10 mM KCl，体积百分数 0.1% Triton X-100， 10 mM (NH4)2SO4， 2 mM MgSO4， -20 保存。 4.3 Bst DNA 聚合酶 8U/L， -20 保存 ， 不 能在 反复冻融或 经历 温度剧烈 变化情况后使用 。 4.4 dNTPs 混合物 含 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP 各 2.5 mol/L 的混合物， -20保存 ， 不宜在 反复

5、冻融或温度剧烈 DB32/T 3925 2020 2 变化 后使用 。 4.5 染色剂 10000 SYBR Green I， -20 避光 保存。 4.6 引物 检测所用 4 条引物，其序列如下 : F3： 5-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3 B3： 5-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3 FIP： 5-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT-3 BIP： 5-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG

6、GGT TTA CGA CAA-3 4.7 阳性对照 阳性对照为 包括 已知 WSSV ORF 234 片段的 pET-28a(+)-234 质粒，且 PCR 及 LAMP 检测结果为 阳性的质粒 DNA 模板。 将提 纯 的 pET-28a(+)-234 质粒根据 OD260 吸光度值计算浓度，用 TE 缓冲液稀 释 至 150 pg/L， -20保存。 4.8 阴性对照 阴性对照为 不含 WSSV 基因的 pET-28a(+)空载质粒，且 LAMP 检测结果为 WSSV 阴性的质粒 DNA 模板。 将提取 pET-28a(+)空载质粒根据 OD260 吸光度值计算浓度，用 TE 稀释至 1

7、50 pg/L， -20保 存。 5 主要 仪器和设备 5.1 高速 冷冻 离心机：最高转速 可达 15000 r/min 以上，配备能使用 1.5 mL 离心管的转头 。 5.2 微量移液器 。 5.3 高精度 恒温 仪 ：控温 精度 0.2。 5.4 凝胶成像仪 或紫外灯 。 5.5 水浴锅 。 6 操作步骤 6.1 取样 待检 的 虾、蟹 ，如 虾 体 长不超过 2 cm，取 将 整个虾去壳，虾体长超过 2 cm，取虾头部，去壳； 蟹 体重不超过 5 g，取整个蟹，去壳，蟹体重超过 5 g，去壳，取组织肝胰腺、心、鳃组织。 样品采集 按 SC/T 7103 2008 中 6.1 的规定执

8、行。 DB32/T 3925 2020 3 6.2 制样 将待检新鲜组织 0.2 g，剪碎后 研磨或进行组织匀浆至无明显组织块后 置于 1.5 ml 离心管内。加入 100 L 模板制备缓冲液，沸水浴 5 min， 12000 r/min 离心 1min，上清转移至新的 1.5 ml 离心管内 ， 样 品应现制现测 。 6.3 LAMP 扩增 按 下 表加入除了 Bst DNA 聚合酶以外的各项试剂，配成无酶反应预混液 。 表 1 25 L LAMP 扩增反应体系 试剂 体 积 (L) 10反应缓冲液 2.5 10 M dNTPs 1 10 M FIP 2 10 M BIP 2 10 M F3

9、 0.5 10 M B3 0.5 灭菌双蒸水 14.5 6.4 配制完全反应预混液 将无酶反应预混物 单支分 装 到 0.2 mL PCR 管中 ，保存于 -20。在临用前， 室温融解 ， 按 23 L 无酶反应预混 液 加 1 L Bst DNA 聚合酶混匀， 配制完全反应预混液 。 6.5 加样 按每管 24 L 完全反应预混液 ，分 别 在对应管中 加入待检样品模板 1 L、阳性对照 pET-28a(+)-234 质粒 1 L、阴性对照 pET-28a(+)空载质粒 1 L，混匀 。 6.6 孵育 将上述 PCR 管置于 高精度 恒温 仪中 ，于 63.0 0.2 反应 55 min。

10、6.7 染色 LAMP 扩增反应结束后，取反应液 1 L，加入到含有 38 L 无菌双蒸水、 1 L 100 倍稀释的 10000 SYBR Green I 的 200 L PCR 管中，混匀后室温放置 3 min， 置于 紫外灯 或凝胶成像仪 下观 察 ，记录结果 。 DB32/T 3925 2020 4 7 结果判断 7.1 LAMP 扩增 产物 在紫外灯或凝胶成像仪下 ，阳性对照出现 绿色荧光，阴性对照 无 绿色荧光，如待 测样品出现绿色荧光 则判定为阳性。 7.2 如阴性对照出现绿色荧光则 判定为 试剂或器械污染。 7.3 如 阳性对照没有出现绿色荧光则 判定为 试剂失效或仪器工作不正

11、常。 白斑综合征病毒 （ WSSV） LAMP 检测 结果示意图参见附录 B。 DB32/T 3925 2020 i 附 录 A (规范性 ) 试剂及其配制 A.1 模板制备缓冲液 分别配制 50 mM Tris-HCl， 100 mM KCl， 50 mM (NH4)2SO4， 20 mM MgSO4 的母液 。 在 46.9 mL 无菌双蒸水中分别加入 40 mL Tris-HCl (50 mM)、 1 mL KCl (100 mM)、 2 mL NH4)2SO4 (100 mM)、 10 mL MgSO4 (2 mM)、 0.1 mL Triton X-100 混匀， 4 保存。 A.2

12、 SYBR Green I 将 10000SYBR Green I 商品原液 10 L 与 990 L 无菌双蒸水混合，装在 聚丙烯类 管中 4 8 密闭避光保存 。 2 个月内使用有效。 A.3 TE 缓冲液（ pH 8.0） 取 5 mL 初始浓度 为 1 mol/L 的 TrisCl (pH 8.0)和 0.5 mol/L 的 EDTA (pH 8.0) 1 mL，向烧杯中加入 400 mL 双蒸水混合均匀，将溶液定容到 500 mL 后高温高压灭菌， 4 8 保存。 DB32/T 3925 2020 ii 附 录 B (资料性 ) 白斑综合征病毒 （ WSSV） LAMP 检测 结果示意图 图 B.1 白斑综合征病毒 （ WSSV） LAMP 检测 结果示意图