DB34 T 3208-2018 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程.pdf

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1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 32082018 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程 Technical Regulation for Isolation and Identification of Goat Contagious Ecthyma Virus 文稿版次选择 2018 - 10 - 20 发布 2018 - 11 - 20 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 32082018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位

2、：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽东方帝维生物制品股份有 限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、亳州市谯城区畜牧兽医局、旌德县畜牧兽医 局、阜南县动物疫病预防与控制中心、肥东县动物疫病预防与控制中心、宿州市动物疫病预防与控制中 心 本标准主要起草人：王桂军、占松鹤、李雪松、祁克宗、朱良强、张星、张利亚、涂健、徐前明、 方保根、冯育宁、陈静、郑举、方定平、兰梦蝶、刘雪梅、周迎春、王军、王楠楠、杨德康、车跃光。 DB34/T 32082018 1 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了羊传染性脓疮病毒病料采集与处理、病毒分离及病毒鉴定技术要点。 本标

3、准适用于羊传染性脓疮病毒的分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试验材料、试剂和仪器 3.1 材料 增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lamb testis cells，LT）、DMEM 培养基、M199 液 体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、0.01 mol/L pH 7.0 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素、链霉素。 3.2 试剂 DNA 提取试剂盒、50 TAE

4、 缓冲液、琼脂糖。 3.3 仪器 细胞培养箱、生物安全柜、高速冷冻离心机、PCR 仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统。 4 样品采集与处理 4.1 样品的采集 按照 NY/T 541 的规定执行，无菌采集疑似羊传染性脓疮病毒感染的病羊口唇、蹄部痂皮。 4.2 样品的保存 样品应置于 -80冷冻保存。 4.3 样品的处理 先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌 PBS 与样品按体积质量比 51 匀浆， 将样品匀浆冻存后再室 温融解，反复三次。经 5000 r/min 离心 10 min，取上清，并加入 青霉素和链霉素，终浓度为 2000 IU/mL，0.22 m 过滤除菌，置于 -80待用。 DB34/T 3

5、2082018 2 5 病毒分离 5.1 传代细胞培养 使用 DMEM 培养液复苏 HeLa 细胞，取 T25 细胞培养瓶密度达到 80的单层 HeLa 细胞，弃去培 养液，用灭菌 PBS 清洗三次，接种 1 mL 处理好的样品，于 5CO 2 培养箱，37下吸附 2 h，期间每 隔 30 min 轻轻摇晃一次。弃去样品液，用灭菌 PB S 清洗三次，加入 5 mL 细胞维持液（血清含量为 2），培养箱内继续培养 5 d。在培养过程中每日观察细胞病变（CPE）产生情况，如出现 CPE（特征 病变为：细胞间隙增大、细胞核固缩、细胞圆化脱落），收集细胞培养上清及细胞裂解液。 同时设立空白对照（见图

6、1）。 A：病变的HeLa细胞； B：对照细胞 图1 接种后第 72 小时病变的 HeLa 细胞和对照细胞 10 5.2 原代细胞培养 5.2.1 原代细胞制作 选择 23 月龄健康雄性绵羊，无菌摘取睾丸，并浸泡于含双抗的 M199 培养基中保存，将睾丸组 织放入平皿中，剥弃髓鞘及白膜，除去脂肪层，用含双抗 的灭菌 PBS 清洗 23 次，放入烧杯中将睾 丸组织剪碎，用含双抗的灭菌 PBS 清洗直至液体清亮，弃去液体，将组织倒入装有玻璃珠的三角瓶中， 按组织量的 4 倍加入胰酶消化液，37消化 30 m in，至睾丸组织呈蓬松状，加入 M199 培养液清洗， 将胰酶消化液彻底冲洗干净，加入适量

7、生长液（含 10 血清的 M199 培养基），用玻璃珠振荡法分散 细胞，6 层纱布进行过滤，取滤液进行细胞计 数，用生长液将细胞密度调整为 100150 万个/mL的细 胞悬液，7 mL/瓶（T25 细胞培养瓶），置 37、5 CO 2 培养箱中进行培养。 5.2.2 病毒分离 使用 M199 培养液培养 LT 细胞， 取 T25 细胞培养瓶密度达到 80的单层 LT 细胞， 弃去培养液， 用灭菌 PBS 清洗三次， 接种 1 mL 处理好的样品， 于 5CO 2 培养箱， 37下吸附 1 h， 期间每隔 15 min 轻轻摇晃一次。吸附完成后，弃去样品液，用灭菌 PBS 清 洗三次，加入 5

8、 mL 细胞维持液（血清含量 为 2），培养箱内继续培养 4 d。在培养过程中每日观察 CPE 产生情况，如出现 CPE，收集细胞培 养上清及细胞裂解液。 同时设立空白对照（见图2）。 DB34/T 32082018 3 A：病变的羊睾丸原代细胞； B：对照细胞 图2 接种后第 72 小时病变的羊睾丸原代细胞和对照细胞 100 6 病毒 PCR 检测 6.1 引物 B2L gene 上游引物：5 -CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCAT-3 B2L gene 下游引物：5 -CGGAATTCTTAATTTATTGGTTTGCAGAACTCC-3 6.2 病毒 DNA 提取与

9、PCR 检测 利用 DNA 提取试剂盒提取待测样品以及羊痘阳性病料 DNA，以此作为 PCR 扩增模板。 PCR 扩增反应条件：94预变性 3 min；94 45s，58 45s，72 70s，30 个循环；最后 72延 伸 10 min。取 PCR 产物用 10 g/ L 琼脂糖凝胶进行电泳检测，阳性结果为在 1137 bp 处扩增出特异 性条带（见图3）。 图中： M DL 2000Marker；1 待检样品；2 羊痘阳性病料；3 阴性对照。 图3 B2L 基因的 PCR 扩增 7 结果判定 DB34/T 32082018 4 7.1 HeLa 细胞接种病料 72 h 后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。 7.2 羊睾丸原代细胞接种病料 72 h 后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。 7.3 PCR 检测结果得到与理论上 B2L 基因片段大小（1137 bp）相符的目的条带大小目的片段时，且 羊痘阳性病料未出现条带，初步判定为羊传染性脓疮病毒阳性，结果具有特异性。 7.4 符合结果判定 7.3，且符合 7.1 或 7.2 时，可确诊被检羊感染羊传染性脓疮病毒。 _