DB51 T 2166-2016 微生物检测领域培养基和试剂验证指南.pdf

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1、 ICS 03.120.10 A 00 DB51 四川省地方标准 DB51/T 21662016 微生物检测领域培养基和试剂验证指南 2016 - 05 - 18 发布 2016 - 10 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 21662016 I 目 次 前 言 . . II 引 言 . . III 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 培养基和 试剂的质量要求及其检查方法 . 3 5 生长率测试 . . 4 6 选择性 . . 7 7 生化特性 . . 9 附录 A（资料性附录） 微生物检验标准中指定的培养基成分 . 12

2、 附录 B（资料性附录） 常用质控菌株中文名和学名一览表 . 13 附录 C（资料 性附录） 常见培养基验证标准 . 14 参考文献 . . 26 DB51/T 21662016 II 前 言 本标准为实验室质量管理和技术运作类标准， 建议实验室将该标准与下列实验室质量管理和技术运 作系列标准结合起来使用。 微生物检测实验室安全管理指南 微生物检测领域设施和环境条件监测指南 微生物检测实验室废弃物处置指南 标准菌株的保存和使用指南 微生物检测领域培养基和试剂管理指南 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则进行起草。 本标准由四川省产品质量监督检验检测院提出并归口。 本标准由四川省质

3、量技术监督局批准。 本标准由四川省产品质量监督检验检测院负责解释。 本标准起草单位: 四川省产品质量监督检验检测院，成都市食品药品监督管理局，四川省食品药品 检验检测院，成都市疾病预防控制中心 本标准主要起草人：时炜，郑卫东，黄薇，黄瑛，文永勤。 DB51/T 21662016 III 引 言 培养基和试剂的质量是微生物检测的关键。只有其质量符合标准或满足最低性能要求，才能保证试 验结果的准确性和可靠性。 本标准提出微生物检测领域培养基和试剂验证的指南，旨在为实验室提供管理的科学路径，以满足 相关要求。 DB51/T 21662016 1 微生物检测领域培养基和试剂验证指南 1 范围 本标准提

4、出了微生物检测领域培养基和试剂的质量要求和验证方法。 本标准适用于微生物检测领域市售和自制培养基和试剂的质量要求和性能测试。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB51/T 2158 实验室服务和供应品采购管理指南 3 术语和定义 3.1 液体培养基 liquid culture medium 一种或多种成分的水溶液。 注： 液体培养基如蛋白胨水、营养肉汤等。试管、三角瓶或瓶子中的液体培养基一般称为“肉汤”。 3.2 固体培养基 solid cul

5、ture medium 在液体培养基中加入一定量固化物，冷却后凝固成固体状态的培养基。 注1 ：固化物如琼脂、明胶等 注2： 倾注到平皿内的固体培养基一般称之为“平板” ； 倒入试管并摆放成斜面的固体培养基，当培养基凝固后 通常称作“斜面”。 3.3 半固体培养基 semi-solid liquid culture medium 在液体培养基中加入一定量固化物，冷却后凝固成半固体状态的培养基。 3.4 运输培养基 transport medium 在取样后和实验室处理前保护和维持微生物活性且不允许明显增殖的培养基。 注： 运输培养基中通常不允许包含使微生物增殖的物质，但是培养基应能保护菌株。典

6、型的运输培养基如缓冲甘 油-氯化钠溶液运输培养基。 3.5 保藏培养基 preservation medium DB51/T 21662016 2 用于在一定期限内保护和维持微生物活力，防止长期保存的不利影响，或使其在长期保存后容易复 苏的培养基。 注： 保藏培养基如营养琼脂斜面。 3.6 复苏培养基 resuscitation medium 能够使受损或应激的微生物修复，使其恢复正常生长能力，但不一定促进其繁殖的培养基。 3.7 增菌培养基 enrichment medium 通常为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供特定的生长环境。 3.8 选择性增菌培养基 selective en ric

7、hment medium 能够允许特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生长的培养基。 注： 选择性增菌培养基如TTB培养基。 3.9 非选择性增菌培养基 non-select ive enrichment medium 能够保证多种微生物生长的培养基。 注： 非选择性增菌培养基如营养肉汤。 3.10 分离培养基 isolation medium 支持微生物生长的固体或半固体培养基。 3.11 选择性分离培养基 selective is olation medium 支持特定微生物生长而抑制其他微生物生长的分离培养基。 注： 选择性分离培养，如XLD琼脂。 3.12 鉴别培养基(特

8、异性培养基) differe ntial medium 能够进行一项或多项微生物生理和（或） 生化特性鉴定的培养基。 注1： 鉴别培养基如麦康凯琼脂。 注2： 能够用于分离培养的鉴别培养基被称作分离（鉴别） 培养基， 如 XLD琼脂。 3.13 计数培养基 count medium 能够对微生物定量的选择性或非选择性培养基。 注1： 能够对微生物定量的选择性培养基如MYP琼脂，能够对微生物定量的非选择性培养基如平板计数琼脂； 注2： 计数培养基可包含复苏和(或) 增菌培养基的特性。 DB51/T 21662016 3 3.14 测试菌株 testing culture 通常用于培养基性能测试的

9、微生物。 注： 测试菌株可按其来源进行进一步定义。 3.15 标准菌株 reference strain 直接从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种水平的菌株,按菌株特性进行分类和描述。 注： 标准物质是指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种，经证明的标准物质是指其浓度已经证明。 3.16 工作菌株 working culture 由标准储备菌株、储备菌株或标准菌株（经证明或未经证明）转接一代获得的菌株。 4 培养基和试剂的质量要求及其检查方法 培养基和试剂的质量要求包括理化特性要求和微生物学要求。 实验室应检查培养基和试剂的质量是 否满足要求。 注： 培养基和试剂的质量由基础成分的质量

10、、制备过程的控制、微生物污染的消除、包装和储存条件等因素决定。 4.1 理化特性要求 培养基和试剂的理化特性应满足相关标准的要求，以下特性的质量评估结果应符合相应的规定： 分装的量和（或）厚度； 外观，色泽和均一性； 琼脂凝胶硬度； 水分含量； 20 25 的 pH； 缓冲能力 注： 国家标准中提到的培养基通常可以直接使用。但因其中一些培养基成分(见附录A) 质量不稳定，可允许对其用 量进行适当的调整，如： 根据营养需要改变蛋白胨、牛肉浸出物、酵母浸出物的用量； 根据所需凝胶作用的效果改变琼脂的用量； 根据缓冲要求决定缓冲物质用量； 根据选择性要求决定胆盐、胆汁抽提物和脱氧胆酸盐、抗菌染料的用

11、量； 根据抗生素的效价决定其用量。 4.2 微生物学 4.2.1 总则 培养基和试剂的微生物学要求包括微生物污染的控制要求和生长特性要求。 4.2.2 实验室应按批量的不同，选择适量的培养基在适当条件下培养，检测其微生物污染。通常的做 法是：在一个时段内，至少要对初始制备的一批和最终制备的一批培养基的污染情况进行检测，且在同 DB51/T 21662016 4 一批培养基中至少应抽取或制备一个平板或试管，或按批量的 1%决定抽取或制备的平板或试管数量， 并置于 37 培养 18 h 或按特定标准中规定的温度和时间进行培养。 注： 本条款只适用于即用型培养基。 4.2.3 生长特性要求包括生长率

12、、选择性、生化特性。实验室应根据培养基或试剂的用途，选择能代 表整批产品的样品，使用测试菌株（常用测试菌株见附录 B）对培养基或试剂进行测试。 4.2.4 对不含指示剂和选择剂的培养基，通常只需采用测试菌株进行生长率测试；对含有选择剂的培 养基或试剂，应使用能证明其选择作用的测试菌株进行选择性测试；对含有指示剂的培养基或试剂，应 使用能证明其指示作用的测试菌株进行生化特性试验。 测试方法包括定量方法、半定量方法、定性方法。常见培养基的生长特性测试见附录 C。 注1： 采用定量方法时，应使用参考培养基进行对照；采用半定量和定性方法时，使用参考培养基或能得到“阳性” 结果的培养基进行对照有助于结果

13、的解释。参考培养基应选择近期批次中质量良好的培养基或是来自其他供 应商的具有长期稳定性的批次培养基或即用型培养基。 注2： 试菌株具有其代表种的稳定特性，是能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株。测试菌株主要购置 于标准菌种保藏中心，也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌株。测试菌株的来源应尽量与检测对象 一致，如对食品微生物检测用培养基进行性能测试时，最好使用从食品或水中分离的菌株。 注3： 测试菌株通常需要采用组合菌株进行验证，如具典型反应特性的生长良好的阳性菌株；弱阳性菌株（对培养 基中选择剂等试剂敏感性强的菌株）；不具有该特性的阴性菌株；部分或完全受抑制的菌株，使用这四类菌 株

14、组成组合菌株进行验证。 5 生长率测试 5.1 总则 生长率是指培养基对（目标）菌的促生长能力。每种培养基上菌株的生长率应达到所规定的最低限 值。 5.2 定量方法 本方法适用于大多数固体培养基（部分霉菌除外）的生长率测试，也可用于保藏培养基、运输培养 基和复苏培养基的生长率测试。 当实验室采用自制培养基或首次使用新供应商的商品化脱水合成培养基产品时， 应采用定量测试方 法进行评价。 5.2.1 固定培养基 按下列程序测试固体培养基的生长率： a) 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少 3 mm 厚的琼脂层（直径 90 mm 的平皿 通常要加入 18 mL20 mL 琼脂培养基）

15、，冷却至 47 50 后添加试剂。倾注后将平板放 到水平平面，使琼脂冷却凝固，并在使用前对琼脂表面进行干燥。 b) 将测试菌株接种到非选择性肉汤培养过夜或采用其他方法，制备 10 倍系列稀释的菌悬液。生长 率测试常用每平板的接种水平为 20 CFU200 CFU。 c) 选择合适稀释度的工作菌悬液 0.1 mL，均匀涂布接种于待测平板和参比平板。每一稀释度接种 两个平板。也可使用倾注法或其他方法进行接种，并按标准规定的培养条件培养平板。 注： 参比培养基的选择，一般细菌采用TSA，一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖琼脂，对营养有特殊要求的微生物采 用适合其生长的不含抑菌剂或抗生素的培养基。 DB51

16、/T 21662016 5 d) 选择菌落数适中的平板进行计数，按式（1） 计算生长率。 PR = NS/N0 .（1） 式中： PR生长率； NS待测培养基平板上得到的菌落总数； N0参比培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应 100CFU）。 e) 要求目标菌在培养基上应呈现典型的生长形态。对于非选择性固体培养基、选择性计数固体培 养基上目标菌的生长率应不小于 0.7；选择性分离固体培养基上目标菌的生长率一般不小于 0.5，最低应为 0.1。参照附录 F 培养基质量控制标准。 5.2.2 保藏培养基、运输培养基和复苏培养基 按下列程序测试保藏培养基、运输培养基和复苏培养基的生长率： a)

17、 将培养基分装试管，每管 10 mL(有特殊要求的可选用 5 mL)。 b) 将测试菌株接种到非选择性肉汤培养过夜或采用其他方法， 制备 10 倍系列稀释的工作菌悬液。 c) 在装有待测培养基的试管中接种 100 CFU1000 CFU 的目标菌，同时接种两个平行管，混匀后， 立即吸取 1 mL 待测培养基混合液，倾注非选择性平板，每管待测培养基接种一个平板。按检 测方法中规定的培养时间和温度培养后，进行菌落计数。 d) 剩余已接种菌液的待测培养基置 20 25 放置 45 min 后，再吸取 1 mL 倾注平板，每管 培养基接种一个平板，按检测方法中规定的培养时间和温度培养后，进行菌落计数。

18、 e) 待测培养基中的菌落数变化应在 50%内。 5.3 半定量方法 本方法适用于液体培养基（包括无选择性液体培养基、选择性増菌培养基和选择性计数培养基）生 长率测试。同时也可作为固体培养基的补充测试。 5.3.1 液体培养基 当实验室采用自制培养基或首次使用新供应商的商品化脱水合成培养基产品配制时， 应采用半定量 测试方法,按下列程序进行评价： a) 将培养基分装试管，每管 10 mL。 b) 将测试菌株接种到非选择性肉汤培养过夜或采用其他制备方法，制备 10 倍系列稀释的工作菌 悬液。 c) 在装有待测培养基的试管中接种 10 CFU100 CFU 的目标菌。若是有选择性的液体培养基，还

19、应同时接种 1000 CFU5000 CFU 的非目标菌。每管接种总量为 1 mL，接种两个平行管，按检 测方法中规定的培养时间和温度进行培养。 d) 用 10 L 接种环取 1 环经培养后的混合菌培养液，划线接种到特定的选择性平板上。每管接 种一个平板。按检测方法中规定的培养时间和温度进行培养。 注： 本步骤仅对选择性増菌培养基适用。 e) 对平板进行目标菌计数或目测培养液浊度值。 注1： 量化浊度值：0 表示无混浊；1 表示很轻微的混浊；2 表示严重的混浊。 注2： 有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时， 小心振荡试管后再进行观察。 DB51/T 2

20、1662016 6 f) 对于选择性增菌培养基，划线接种后，目标菌在选择性平板上的菌落应10 CFU。无选择性的 液体培养基和选择性计数液体培养基，浊度值应为 2，且有目标菌的生长特征。如乳糖胆盐培 养基，产气应为 1/3 或以上。 5.3.2 固定培养基 当实验室采用商品化即用型固体培养基，以及使用新批次的商品化脱水合成培养基时，可采用半定 量测试方法，按下列程序进行评价: a) 按照 5.1.1. a)的要求制备与保存平板。 注 ： 本步骤不适用于 商品化即用培养基。 b) 将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜，此为工作菌悬液。 用1 L 接种环，在平板上按图 1 所示顺序和方向划线。

21、图 1 所示 A、B、C 三个区域中，用接种环 按0.5 cm 的间隔划 4 条平行线，再在 D 区域内划一条连续的曲线。可在培养皿下面放一个模板图， 以便于准确划线。按同样的方法同时接种两个平板，按检测方法规定的培养条件培养。 图1 目标菌半定量划线法接种模式图 注1： 操作时用接种环而不用接种针，接种环应完全浸入培养基中。取一满环接种物，将接种环接触容器边 缘 3 次可去除多余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为 2030。接种环压在琼脂表面的压力 和划线速度前后一致，整个划线应快速连续，移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产 生气泡或泡沫。 注2： 通常只用一个接种

22、环划线，操作过程不需要对接种环灭菌。但为了得到低生长指数 G，在接种不同部分 时应更换接种环或对其灭。 c) 培养完成后，评价菌落的形状、大小和生长密度，计算生长指数 G。如果划线上有较为稠密的 菌落生长，则此划线的 G 值记为 1；如果划线上仅一半有稠密菌落生长，则 G 值为 0.5；如果 划线上没有菌落生长，或生长量少于划线的一半，或菌落生长微弱，则 G 值为0。在培养皿上 按 5.2.2c)所示方法划线后，共有 16 条划线，所以培养皿最大 G 值为 16。记录各个平板的得 分总和便得到该平板的 G 值。例如，菌落在 A 区和 B 区全部生长，而在 C 区有一半线生长，则 G 值为10。

23、 d) 目标菌在培养基上应呈现典型的生长， 且目标菌的生长指数 G 大于或等于 6 时， 培养基可接受。 5.4 定性方法 5.4.1 总则 本方法通常作为液体培养基的补充测试。当实验室使用商品化即用型液体培养基，以及使用新批次 的商品化脱水合成培养基时，可采用本方法进行测试。 5.4.2 増菌培养基 DB51/T 21662016 7 按下列程序进行测试 ： a) 将培养基分装至试管，每管 10 mL。 注： 本步骤不适用于商品化即用培养基。 b) 将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜，进行 10 倍系列稀释至 10 -3 ，或采用其他方法, 制备成 10 5 CFU/mL10 7 CF

24、U/mL 的菌悬液作为工作菌悬液。 c) 用1 L 接种环取一环工作菌悬液，直接接种到用于性能测试的液体培养基中，按适合的培养 时间和温度进行培养。 d) 目测其浊度值：0 表示无混浊；1 表示很轻微的混浊； 2 表示严重的混浊。 e) 目标菌的浊度值应为 2，非目标菌的浊度值应为 0 或1。 注： 有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时，小心振试管后再进行 观察。 选择性液体计数培养基目标菌应有产气现象，非目标菌无产气现象。 5.4.3 保藏培养基、运输培养基和复苏培养基 按下列程序进行测试： a) 按照 5.2.2 a）的要求制备培养基。 注： 本步骤

25、不适用于商品化即用培养基。 b) 将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜，此为目标菌工作菌悬液。 c) 用1 L 接种环取一环工作菌悬液， 直接接种到装有待测培养基的试管中,混匀后， 立即用 10 L 接种环取一环工作菌培养物划平行线接种平板，按检测方法中规定的培养时间和温度培养；将 剩余已接种菌液的待测培养基置于 20 25 环境中，放置 45 min 后，再用 10 L 接种环 取一环工作菌培养物，划平行线接种平板，按检测方法中规定的培养时间和温度培养。如果待 测培养基保存条件有特殊要求，应参照相关标准要求放置或培养后再进行划线接种。 d) 接种前后平板上目标菌的生长情况应均为良好。 6

26、 选择性 6.1 总则 选择性是指培养基对非目标菌的抑制能力。应按照相关规定，用适当方法，将适量测试菌株的工作 培养物接种至选择性培养基中培养。培养基的选择性应达到附录 C 规定的要求。 6.2 半定量法 本方法适用于各类液体与固体培养基的选择性测试。 当实验室采用自制培养基或采用新批次商品化 脱水合成培养基产品时，应采本方法评价。 6.2.1 固定培养基 按下列程序进行测试： a) 按照 5.2.1 a)的要求进行平板制备与保存。 b) 将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜，此为工作菌悬液。 c) 用1 L 接种环取选择性测试工作菌悬液 1 环， 按图 2 所示，在待测培养基表面划六条平

27、行直 线。可在培养皿下面放一个模板图，以便于准确划线。按同样的方法同时接种两个平板，按检 测方法规定的培养条件培养。 DB51/T 21662016 8 图2 非目标菌半定量划线法接种模式图 注： 注意事项见5.3.2 c) d) 培养后计算培养基的生长指数 G。划线上有比较稠密菌落生长，则此划线的 G 值为 1。培养皿 上有 6 条线，故 G 值最多为 6。如果划线上仅一半有稠密菌落生长，则 G 值为0.5。 如果划线 上没有菌落生长，或生长量少于划线的一半，或菌落生长微弱，则 G值为 0。记录每个平板的 得分总和便得到 G 值。 e) 非目标菌的生长指数 G值一般小于或等于 1，最多不大于

28、 5。 6.2.2 液体培养基 按下列程序测试液体培养基的选择性： 将培养基分装试管，每管 10 mL。 按 5.2.1b) 的要求制备工作菌悬液。 在装有待测培养基的试管中接种 1000 CFU500 0 CFU 非目标菌，接种量为 1 mL，同时接种两个 平行管，混匀。同时将 1 mL 菌悬液(比试管接种小 10100 倍稀释度)倾注平板，接种两个平板，作 接种量计数用。按检测方法中规定的培养时间和温度进行培养。 吸取 10 L 经培养后的非目标菌培养液，均匀涂布接种到非选择性平板（如 TSA）上。同时每管 接种一个平板。可使用倾注法进行接种，并按标准规定的培养条件培养平板。 该步骤仅针对

29、选择性増菌液体培养基。 对平板进行目标菌计数或目测培养液浊度值。 注1： 浊度值为：0 表示无混浊；1 表示很轻微的混浊；2 表示严重的混浊。 注2： 有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时，小心振荡试管后再 进行观察。 非目标菌在非选择性平板上的菌落数应100 CFU 或非目标菌的浊度值应为 0 或1 且无产气等现象。 6.3 定性方法 6.3.1 本方法可作为液体培养基的补充测试。当实验室使用商品化即用型液体培养基或采用新批次商 品化脱水合成培养基产品时，可采用本方法进行测试。 6.3.2 培养基的制备 将培养基分装试管，每管 10 mL。本步骤不适用

30、于商品化即用培养基。 6.3.3 工作菌悬液的制备 按照 5.3.1 b)的要求进行。 6.3.4 接种 按照 5.3.1 c）的要求进行。 6.3.5 结果观察 目测其浊度值：0 表示无混浊；1 表示很轻微的混浊； 2 表示严重的混浊。 6.3.6 结果解释 非目标菌的浊度值应为 0 或1。选择性液体计数培养基还应无产气现象。 注： 有时可以观察到微生物生长后聚集成细胞团，沉积在试管或瓶子底部，发生这种情况时，小心振试管后再进行 观察。 DB51/T 21662016 9 7 生化特性 7.1 总则 培养基的生化特性又称为特异性，是指培养基和试剂对微生物的菌落形态学、生化试验、耐药性、 血清

31、学反应等的鉴别能力。通常采用定性方法进行试验。 7.2 菌落形态学 7.2.1 目标菌测试 在进行生长率测试时同步完成，目标菌应有典型的菌落外观、大小和形态。 7.2.2 非目标菌测试 7.2.2.1 平板的制备与保存, 按照 5.2.1a)的要求进行。本步骤不适用于商品化即用培养基 。 7.2.2.2 工作菌悬液的制备，按照 5.2.1b)的要求进行。 7.2.2.3 接种，用 1 L 接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线。 并按检测方法规定的 培养条件培养平板。 7.2.2.4 结果解释，非目标菌应有典型的菌落外观、大小和形态。 7.3 生化试验 7.3.1 液体培养基 7.3.

32、1.1 培养基的制备,将培养基分装试管，再进行灭菌和添加试剂。本步骤不适用于商品化即用培养 基。 7.3.1.2 工作菌悬液的制备,将标准储备菌株接种到非选择性肉汤中或采用其他制备方法，制备成 5 McFarland 浊度（约10 9 CFU/mL） 的菌悬液。 7.3.1.3 接种 吸取0.05 mL0.08 mL（约12 滴）菌悬液至待测培养基内，按检测方法中规定的 培养时间和温度进行培养。 7.3.1.4 指示剂的加入与结果观察,在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，再观察结果。 7.3.1.5 结果解释, 测试菌株应有典型的生化特征。 7.3.2 固体与半固体培养基 7.3.2.

33、1 培养基的制备,将培养基分装试管，灭菌后竖立放置或摆放成斜面，冷却后备用。本步骤不适 用于商品化即用培养基。 注1： 高层斜面，其斜面与底层高度约为2:3。 注2： 普通斜面，其斜面与底层高度约为3:2。 7.3.2.2 接种,取新鲜质控菌株斜面， 接种于培养基中， 按检测方法中规定的培养时间和温度进行培养。 注1： 高层斜面培养基，取新鲜质控菌株斜面，用接种针挑取菌苔穿刺接种至琼脂高层， 穿刺接种完毕后，再在斜 面上划“之” 字形接种。 注2： 斜面培养基，取新鲜质控菌株斜面，用接种环挑取菌苔在斜面上划“之” 字形接种。按检测方法中规定的培 养时间和温度进行培养。 注3： 其它培养基，取新

34、鲜质控菌株斜面，用接种针挑取菌苔穿刺接种。 7.3.2.3 指示剂的加入与结果观察,在微生物生长良好的情况下，按顺序加入指示剂，再观察结果。 7.3.2.4 结果解释,应有与测试菌株一致的生化结果表现。 7.4 耐药性 DB51/T 21662016 10 7.4.1 平板的制备与保存 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个厚度为 4 mm5 mm 的琼脂层。倾注后将平板 放到水平平面，使琼脂冷却凝固。使用前应将平板置 35 温箱中或置室温层流橱中对琼脂表面进行干 燥，培养基表面应湿润，但不能有水滴，培养皿也不应有水滴。 本步骤不适用于商品化即用培养基。 7.4.2 质控菌株的复苏 将

35、质控菌株接种到无选择性平板上，按检测方法中规定的培养时间和温度进行培养。检查纯度合格 后，用于质控工作菌悬液的制备。 7.4.3 质控菌工作菌悬液的制备 将纯度满意的质控菌株培养物悬浮于TSB肉汤中，并调整浊度为0.5麦氏标准（约110 8 CFU/mL2 10 8 CFU/mL）。 7.4.4 接种 用涂布法将质控工作菌悬液接种于测试平板上，并贴上相应的抗生素纸片(每平板最多贴 6 片)，将 平板翻转后按检测方法中规定的培养时间和温度进行培养。 调整菌悬液浊度与接种所有平板间的时间间 隔不要超过 15 min。 7.4.5 结果观察 在无反射黑色背景下，观察有无抑菌环。 7.4.6 结果解释

36、 抑菌环的有无应与测试菌株一致。 7.5 血清学反应 7.5.1 抗原的准备 将测试菌株接种到无选择性平板上，按检测方法中规定的培养时间和温度进行培养。检查纯度合格 后，可作为玻片凝集试验用的抗原。 注1： 一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 注2： 部分抗原可能需要煮沸处理或相位诱导，按照检测方法中规定的步骤进行操作。 7.5.2 玻片凝集 取干净玻片，在玻片上划出2个约1cm2cm的区 域，用接种环挑取1环测试菌株，各放1/2环于玻片 上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。 再用无菌的接种环分别将两个区域内的菌落研

37、成乳状液。 将玻片倾斜摇动混合1min。 7.5.3 结果观察 在无反射黑色背景下，观察有无凝集现象。任何程度的凝集现象皆为阳性反应. 7.5.4 结果解释 DB51/T 21662016 11 凝集试验的结果应与测试菌株一致。 DB51/T 21662016 12 A A 附 录 A （资料性附录） 微生物检验标准中指定的培养基成分 A.1 蛋白胨 酶解酪蛋白：包括胃蛋白酶消化的酪蛋白和胰蛋白酶消化的酪蛋白与胰蛋白胨。 酶解大豆粉。 酶解动物组织：包括肉胨、胃蛋白酶消化的肉组织和胰酶消化的肉组织。 心酶解物。 酶解明胶。 酶解动物组织、 植物组织：包括包括蛋白示、 胨。 A.2 浸膏 肉浸膏

38、。 脑心浸膏。 酵母浸膏。 细菌学牛胆汁。 胆盐。 3 号胆盐。 A.3 琼脂 细菌学琼脂。 A.4 其他 卵黄乳液。 脱脂奶粉。 酸水解酪蛋白。 DB51/T 21662016 13 B B 附 录 B （资料性附录） 常用质控菌株中文名和学名一览表 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 单核细胞增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes 福氏志贺氏菌 Shigella fl exneri 英诺克李斯特氏菌 Li steria innocua 痢疾志贺氏菌 Shigella dy senteriae 小肠结肠炎耶尔森氏菌 Yersinia enterocoliti

39、ca 宋内志贺氏菌 Shigella so nnei 弗氏柠檬酸杆菌 Citrobact er freundii 阪崎肠杆菌 Enterobacter sak azakii 婴儿双岐杆菌 Bifid obacterium infantis 产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes 德氏乳杆菌保加利亚亚种 Lactobacillus delbr ueckii subsp. Bulgaricus 肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella pneumoniae 粪产碱杆菌 Al caligenes faecalis 伤寒沙门氏菌 Salmonella ty phi 植物乳杆菌 Lacto

40、 bacillus plantarum 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium 硝酸盐阴性不动杆菌 Ac inetobacter anitratum 肠炎沙门氏菌 Salmonella enteritidis 创伤弧菌 vibrio vulnificus 奇异变形杆菌 Proteus mir abilis 霍乱弧菌 Vibrio cholerae 普通变形杆菌 Proteus vulga ris 副溶血性弧菌 Vibri o parahaemolyticus 空肠弯曲菌 Campylobacter je juni 溶藻弧 菌 Vibrio algi nolyticus 结

41、肠弯曲菌 Campylobacter co li 铜绿假 单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 嗜水气单胞菌 Aeromonas h ydrophila 枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis 粪肠球菌 Enterococcu s faecalis 蕈状芽胞杆菌 Bacil lus mycoides 金黄色葡萄球菌 Staphylococcu s aureus 产气荚膜梭菌 Clost ridium perfringens 表皮葡萄球菌 Staphylococcu s epidermidis 艰难梭菌 Cl ostridium difficile 嗜热链球菌 Stre

42、ptococcus ther mophilus 酿酒 酵母 Saccharomyc es cerevisiae 蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus DB51/T 21662016 14 C C 附 录 C （资料性附录） 常见培养基验证标准 表C.1 非选择性分离和计数固体培养基质量控制标准 培养基 状态 功能分类 质控指标 培养条件 质控菌株 参比培 养基 方法 质控评定标准 特征性反应 大肠埃希氏菌ATCC 25922 胰蛋白胨大豆琼 脂 固体 非选择性 分离 生长率 361 24h2h 粪肠球菌 ATCC 29212 TSA 定量 PR0.7 MC培养基 固体 非选择性 计数

43、生长率 361 48h2h 嗜热链球菌IFFI6038 MC 培养 基 定量 PR0.7 中等偏小，边缘光滑的红色菌 落，可有淡淡的晕 德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC6032 圆形凸起， 中等大小， 边缘整齐， 无色不透明 嗜热链球菌IFFI6038 圆形凸起， 菌落偏小， 边缘整齐， 无色不透明 MRS培养基 固体 非选择性 计数 生长率 361 48h2h 婴儿双歧杆菌CICC6069(厌 氧培养） MRS 培养 基 定量 PR0.7 圆形，中等大小，边缘整齐，瓷 白色 副溶血性弧菌ATCC17802 3%氯化钠胰蛋白 胨大豆琼脂 （TSA) 固体 非选择性 分离 生长率 361 18h

44、24h 创伤弧菌落ATCC 27562 3%氯化钠 TSA 定量 PR0.7 无色半透明菌落 大肠埃希氏菌ATCC 25922 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 营养琼脂 固体 非选择性 分离 生长率 361 24h 枯草芽胞杆菌ATCC 6633 TSA 定量 PR0.7 含0.6%酵母浸膏 的胰酪胨大豆琼 脂（TSA-YE) 固体 非选择性 分离 生长率 301 24h48h 单核细胞增生李斯特氏菌 ATCC 19115 TSA 定量 PR0.7 大肠埃希氏菌ATCC 25922 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 平板计数琼脂 （PCA) 固体 非选择性 计数 生长率 361 48h2

45、h 枯草芽胞杆菌ATCC 6633 TSA 定量 PR0.7 DB51/T 21662016 15 表C.2 选择性分离和计数固体培养基质量控制标准 培养基 状态 功能分类 质控指标 培养条件 质控菌株 参比培养基 方法 质控评定 标准 特征性反应 伤寒沙门氏菌CMCC(B)50071 黑色菌落，有金属光泽 生长率 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 TSA 定量 PR0.5 黑色或灰绿色菌落，有金属 光泽 大肠埃希氏菌ATCC 25922 亚硫酸铋琼脂 （BS) 固体 选择性分 离 选择性 361 40h48h 粪肠球菌 ATCC 29212 半定量 G1 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028

46、 绿-蓝色菌落，有黑心 生长率 福氏志贺氏菌CMCC(B)51572 TSA 定量 PR0.5 绿-蓝色菌落 大肠埃希氏菌ATCC 25922 G5 橙红色菌落，可有胆酸沉淀 HE琼脂 固体 选择性分 离 选择性 361 18h24h 粪肠球菌 ATCC 29212 半定量 G1 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 黑色菌落 生长率 福氏志贺氏菌CMCC(B)51572 TSA 定量 PR0.5 无色菌落，无黑心 大肠埃希氏菌ATCC 25922 G5 黄色菌落 木糖赖氨酸脱氧 胆盐琼脂（XLD) 固体 选择性分 离 选择性 361 18h24h 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 半定量 G1 生长率 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 TSA 定量 PR0.5 按说明书判定 大肠埃希氏菌ATCC 25922 按说明书判定 特异性 奇异变形杆菌CMCC(B)49005 定性 按说明书判定 沙门氏菌显色培 养基 固体 选择性分 离 选择性 361 18h24h 粪肠球菌 ATCC 29212 半定量 G1 生长率 单核细胞增生李斯特氏菌 ATCC19115