DB15 T 4447-2026 葡萄病毒鉴定技术规程.pdf

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1、ICS65.020.01CCSB 1615内蒙古自治区地方标准DB15/T 44472026葡萄病毒鉴定技术规程Code of practice for detection of grapevine viruses2026-06-15 发布2026-07-15 实施内蒙古自治区市场监督管理局 发 布DB15/T 44472026I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC 25）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、乌海市农业发展中心、内蒙古自治区农牧

2、业技术推广中心、乌海市绿农永胜农民专业合作社、呼和浩特海关、内蒙古自治区农牧厅综合保障中心。本文件主要起草人：李正男、张磊、孙平平、何霖、郭燕玲、张广越、张欣、郭永胜、郭孟泽、张贵生、李喆。DB15/T 444720261葡萄病毒鉴定技术规程1范围本文件规定了内蒙古葡萄病毒鉴定技术的检验对象、取样、鉴定方法和判定规则等内容。本文件适用于内蒙古葡萄种植区的葡萄病毒鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 34265Sange

3、r法测序技术指南GB/T 40974核酸样本质量评价方法SN/T 2497.21进出口危险化学品安全试验方法 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1反转录-聚合酶链式反应reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)提取葡萄检材的总 RNA，以其中的 mRNA 为模板，利用反转录酶反转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行聚合酶链式反应。4检测病毒种类葡萄蚕豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus，GFabV）。葡萄斑点病毒（grapevine fleck virus，GFkV）

4、葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）。葡萄卷叶相关病毒 2（grapevine leafroll-associated virus 2，GLRaV-2）。葡萄卷叶相关病毒 3（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）。葡萄灰比诺病毒（grapevine Pinot gris virus，GPGV）。沙地葡萄茎痘相关病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）。葡萄病毒 B（grapevine vir

5、us B，GVB）。葡萄病毒 E（grapevine virus E，GVE）。5取样5.1 取样时间DB15/T 444720262于葡萄新梢生长期进行取样，避免在高温干旱或植株休眠期采集。5.2 取样部位疑似病毒感染的葡萄植株，症状表现如叶片褪绿黄化、皱缩畸形、萎蔫、坏死等。采集植株幼嫩茎秆、叶片和叶柄，置于自封袋内。对于未表现明显症状的植株，应随机选取不同方位的幼嫩茎秆、叶片和叶柄，置于自封袋内。5.3 样品保存样品置于4 条件下保存，应在24 h内完成检测。样品置于-20 条件下保存，应在7 d内完成检测。样品经液氮预冷后，置于-80 条件下长期保存。6RT-PCR 检测6.1样品核酸

6、提取选择市售的用于提取含有多糖多酚材料RNA的试剂盒，按照试剂盒自带的说明书进行操作。核酸质量评价按照GB/T 40974执行。6.2反转录以提取的质量合格的总RNA为模板，选择市售的具有基因组DNA去除功能的反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA。反应体系和反应程序按照试剂盒自带的说明书进行设置。6.3PCR 扩增6.3.1 PCR 反应体系市售产品通常为预混液或单品，根据所选产品提供的说明书，进行PCR反应混合物配制，并按说明书指示加入cDNA模板以及病毒检测引物，开展反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。各种病毒名称及其特异性检测引物见表1。表 1葡萄病毒的特异性引物及相关参数病毒引

7、物名称引物序列 5-3退火温度片段大小 bp参 考 序 列NCBI 登录号GFabVGFabV-FGGAAATAACATTCCCAGGAAG49325MZ327141GFabV-RTCCTGCTGTCAAATTTCATTCGFkVGFkV-FGGCCAGGTTGTAGTCGGTGTTGTC59352OR640093GFkV-RTGGTCCTCGGCCCAGTGAAAAAGTAGINVGINV-FWMGKGTTTCTGGGAAGATTGC48968BK011148GINV-RKACSAGATCCCTCAATTCCTGDB15/T 444720263表 1葡萄病毒的特异性引物及相关参数（续）病毒引

8、物名称引物序列 5-3退火温度片段大小 bp参 考 序 列NCBI 登录号GLRaV-2GLRaV-2-FGGTGATAACCGACGCCTCTA54597KM012094GLRaV-2-RCCTAGCTGACGCAGATTGCTGLRaV-3GLRaV-3-FCGCTAGGGCTGTGGAAGTATT54546OR478445GLRaV-3-RGTTGTCCCGGGTACCAGATATGPGVGPGV-FTGAGATCAACAGTCAGGAGAG52544PQ204589GPGV-RGAAGCCGTGATAGCATTAGTCGRSPaVGRSPaV-FTGAAGGCTTTAGGGGTTAG4

9、7905MZ962871GRSPaV-RCTTAACCCAGCCTTGAAATGVBGVB-FATCAGCAAACACGCTTGAACCG55460MZ962922GVB-RGTGCTAAGAACGTCTTCACAGCGVEGVE-FTGTGGGGTGCATAGTCATAGGTTT56478MZ962929GVE-RGCTTTTGACTCCATTGGCTTTCTC6.3.2 PCR 反应程序95 预变性2 min。35个反应循环：95 变性20 s；退火20 s，退火温度按引物合成报告设置，两个引物退火温度不一致时，取较低温度；72 延伸，延伸时间根据所选产品说明书提供的参数进行计算。最后，7

10、2 终延伸5 min。6.4琼脂糖凝胶电泳检测6.4.1 琼脂糖凝胶制备用Tris-乙酸缓冲液溶解琼脂糖，制备质量体积比为1%的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的制备按照SN/T2497.21执行。6.4.2 电泳检测用Tris-乙酸缓冲液，在水平板电泳槽中进行电泳。上样、电泳按照SN/T 2497.21执行。电泳结束时，凝胶置于紫外灯或凝胶成像系统进行观测和拍照，获取的图片用于结果判定。7结果判定待检样品若出现与表1所列病毒预期扩增片段大小一致且条带清晰、位置正确的目标条带，应判定为相应病毒阳性；若未出现预期扩增片段，或扩增条带大小与表1所列预期结果不符，则判定为阴性。当阳性对照未扩增出预期大小的目标条带，或阴性对照、空白对照扩增出预期大小的目标条带时，本次检测结果无效，应重新进行RT-PCR检测。DB15/T 4447202648结果验证当不具备阳性对照，只有阴性对照时，应当随机选取35个被判定为阳性的样品，对扩增的DNA片段进行序列测定，序列测定按照GB/T 34265执行，根据序列信息确证是否携带病毒。9病毒检出率病毒检出率为阳性样品数量占检测样品总数的百分比，按照公式（1）。=100%.(1)式中：R病毒检出率；PP病毒阳性样品数量；Pt检测样品总数。