DB15 T 2192-2021 北方主要牧草中17种霉菌毒素的测定 液相色谱-串联质谱法.pdf

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1、 ICS 65.020.20 CCS B25 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 21922021 北方主要牧草中17种霉菌毒素的测定液 相色谱串联质谱法 Determination of 17 mycotoxins in main northern foragesHPLC-MS/MS method 2021-05-25发布 2021-06-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 21922021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19

2、）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：张福金、张欣昕、史培、孙林、刘广华、杨永青、羿静、莎娜、栗艳芳、吴海 波、郭艳琼、刘浩。 DB15/T 21922021 1 北方主要牧草中17种霉菌毒素的的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了青贮玉米、苜蓿和燕麦草中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2 毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15 -乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、杂色 曲霉素、伏马毒素 B1、B2、B3、玉米赤霉烯酮、青霉酸和展青霉素等17种霉菌毒素的液相色谱-串联质 谱的测定方法。 本文件适

3、用于北方牧草中，青贮玉米、苜蓿和燕麦草的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、 T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀 菌烯醇、杂色曲霉素、伏马毒素 B1、B2、B3 、玉米赤霉烯酮、青霉酸和展青霉素等17种霉菌毒素的测 定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样

4、 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 样品中的霉菌毒素用乙腈和甲酸水溶液提取后，经分散固相萃取净化，液相色谱-串联质谱仪进行 测定，采用保留时间和质谱碎片及其离子丰度比定性，内标法定量。 5 试剂和材料 5.1 除另有规外，本文件所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 5.2 乙腈：色谱纯。 5.3 甲酸：色谱纯。 5.4 0.1 %甲酸水溶液：取1.0 mL甲酸（5.3）加水稀释至1000 mL。 5.5 提取液：0.1 %甲酸水溶液（5.4）和乙腈（5.2）混合液（20：80，体积比）。 DB15/T 2

5、1922021 2 5.6 氯化钠。 5.7 无水硫酸镁：研磨后在650 马弗炉内烘至恒重，置于干燥器中保存。 5.8 0.1 % 甲酸水-乙腈溶液：0.1 %甲酸水溶液（5.4）和乙腈（5.2）混合液（90：10，体积比）。 5.9 标准品 5.9.1 霉菌毒素标准品：黄曲霉毒素B1、B 2、G 1、G 2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐 镰刀菌烯醇、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、杂色曲霉素、伏马毒 素 B 1、B 2、B3、玉米赤霉烯酮、青霉酸和展青霉素17种标准品，纯度均大于95 %，17种霉菌毒素标准 品的信息见附录A中的表A.1。

6、 5.9.2 霉菌毒素稳定同位素标准品：黄曲霉毒素B1- 13 C17、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 13 C15、伏马毒素B1- 13 C34 和玉米赤霉烯酮 13 C18，纯度均大于98 %。4种霉菌毒素稳定同位素标准品的信息见附录A中的表A.1。 5.10 标准溶液配制 5.10.1 单标标准储备液：准确称取（精确至0.01 mg）适量的17种标准品（5.9.1），分别于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释、定容，配制成标准储备液，避光保存于-18 冰箱内，有效期3个月，单标标 准储备液的浓度，按照附录B中的表B.1执行。 5.10.2 混合标准中间液：分别准确吸取适量的17种霉菌毒素的单标标准储备液

7、（5.10.1）至10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释、定容，配制成混合标准中间液，避光保存于- 18 冰箱内，有效期1个月，混 合标准中间液的浓度按照附录B中的表B.2执行。 5.11 稳定同位素内标溶液配制 5.11.1 稳定同位素的单标储备液：准确称取（精确至0.1 mg）适量的8种霉菌毒素的稳定同位素标 准品（5.9.2），分别于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释、定容，配制成稳定同位素单标的标准储备液，避 光保存于-18 冰箱内，有效期3个月，稳定同位素单标标准储备液的浓度，按照附录B中的表B.1执 行。 5.11.2 稳定同位素内标混合中间液：分别准确吸取适量的4种稳定同位素的单标储备液（

8、5.11.1）至 10 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，配制成稳定同位素混合标准中间液，避光保存于- 18 冰箱内， 有效期1个月，稳定同位素混合标准中间液的浓度，按照附录B中的表B.2执行。 5.12 基质匹配标准系列工作液 根据需要，用空白样品的基质溶液，系列稀释混合标准中间液（5.10.2）和稳定同位素内标混合中 间液（5.11.2），配制基质混合工作液，使用前临时配制。 5.13 键合硅固相萃取吸附剂：C18，15 mm；PSA，0.15 mm。 5.14 微孔过滤膜（尼龙）：13 mm 0.2 m。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 6.2 分析天

9、平：感量0.01 mg和0.01 g。 DB15/T 21922021 3 6.3 离心机：转速大于等于 10 000 r/min。 6.4 超声波清洗器。 6.5 涡旋混合器。 6.6 氮气吹干仪。 7 样品采集和制备 按照GB/T 14699.1 规定采集样品，按照GB/T 20195规定制备样品。 8 测定步骤 8.1 提取 准确称取2 g样品(精确到0.01 g)于50 mL离心管中，加入20.0 mL提取液（5.4），涡旋振荡1 min， 超声提取10 min，以10000 r/min的转速离心5 min。 8.2 净化 移取上清液2.00 mL于10 mL离心管中，加入氯化钠（5.

10、6）100 mg，无水硫酸镁（5.7）200 mg ， C18 （5.13）50 mg，PSA（5.13）50 mg，涡旋混合1 min，以6000 r/min的转速离心5 min，取上层乙腈相， 40 氮吹，浓缩约至0.3 mL，准确加入稳定同位素内标混合中间液（5.11.2）50 L，涡旋30 s，用 0.1 %的甲酸水溶液-甲醇（5.8）稀释至1.0 mL，再涡旋30 s，过0.2 m微孔过滤膜，转移至上机样品 瓶，待测。 8.3 空白样品提取液的制备 取不含待测物的空白样品，按8.1和8.2步骤制备空白样品提取液，用于配制基质混合标准工作液。 8.4 测定 8.4.1 液相色谱-串联质

11、谱测定条件 液相色谱和质谱参数可参考下列条件: 色谱柱：C18：100 mm 2.1 mm（内径），粒径：1.7 m，或相当者； 流动相：A：0.1 %甲酸溶液（5.4），B：乙腈（5.2），梯度洗脱见表1； 表1 梯度洗脱表 时间 min 流速 mL/min A / % B / % 0.00 0.35 97.0 3.0 1.00 0.35 95.0 5.0 8.00 0.35 5.0 95.0 9.00 0.35 3.0 97.0 柱温：40 ； DB15/T 21922021 4 进样量：1 L； 离子源：电喷雾（ESI）； 扫描方式：正离子扫描模式； 检测方式：多反应监测（MRM）； 电

12、离电压：2500 V； 离子源温度：120 ； 雾化温度：450 ； 锥孔气流速：50 L/h； 雾化气流速：650 L/h； 待测物定性定量离子对的锥孔电压、碰撞能量见见附录C表C.1。 8.4.2 定性测定 在相同条件下进行样品测定时，如果样品中待测物的色谱峰保留时间与标准品色谱峰保留时间相差 在2.5 %以内，且样品色谱图中定性离子的相对离子丰度与浓度相近的基质标准工作液色谱图中对应 的定性离子相对丰度进行比较，相对偏差不超过表2 规定的范围，则可判断样品中存在该种待测物。 表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度/% 50 20 50 10 20 10 允许最大偏差/%

13、 20 25 30 50 8.4.3 定量测定 在仪器最佳工作条件下，对混合工作液（5.12）和制备的样品（8.2）进行分析，黄曲霉毒素B1 -13C17 作为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、杂色曲霉素、赭曲霉毒素A的内标物，脱氧雪腐镰刀菌烯醇13C15作为 T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀 菌烯醇的内标物，伏马毒素B1-13C34作为伏马毒素B1、B2、B的内标物，玉米赤霉烯酮13C18作为玉米赤 霉烯酮、青霉酸和展青霉素的内标物。 在上述色谱和质谱条件下，标准工作液中的各特征离子多反应监测（MRM）色谱图参见附录D中

14、的图 D.1。 8.5 平行试验 按上述步骤，对同一样品进行平行试验测定。 8.6 空白实验 除不称取样品外，均按上述分析步骤进行。 9 结果计算 样品中待测物的测定结果可由仪器工作软件计算或按式（1）计算，计算结果用平行测定的算术平 均值表示，保留2位有效数字： 2 1 V V mAAc VAAcc X sisi sii = （1） DB15/T 21922021 5 式中： X 样品中待测物的含量，g/kg； C 标准工作溶液中待测物的浓度，g/L； Ci 样品中待测物的内标物的浓度，g/L； A 样品中的待测物的峰面积； Asi 标准工作溶液中待测物对应的内标物峰面积； V 样品溶液定容

15、体积，mL； Csi 标准工作溶液中待测物对应的内标物浓度，g/L； Ai 样品中待测物的内标物的峰面积； As 标准工作溶液中待测物的峰面积； m 样品的称样量，g。 V1 样品溶液提取体积，mL； V 2 样品溶液分取体积，mL。 10 检出限、回收率和精密度 10.1 检出限和定量限 本文件样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯 醇、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、杂色曲霉素、伏马毒素B1、B2、 B3、玉米赤霉烯酮、青霉酸和展青霉素17种霉菌毒素的检出限和定量限，应符合附录E中的表E.1的规定。

16、 10.2 回收率 本文件样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯 醇、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、杂色曲霉素、伏马毒素B1、B2、 B3、玉米赤霉烯酮、青霉酸和展青霉素17种霉菌毒素的回收率，见附录F中的表F.1。 10.3 精密度 在实验室内重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均值15 %，在实验室间 再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均值的20 %。 DB15/T 21922021 6 附录A （资料性） 17 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的相关信息 1

17、7 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的相关信息见表A.1。 表A.1 17 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的相关信息 序号 名称 英文名称 简称 分子式 01 黄曲霉毒素B1 Aflatoxin B1 AFB1 C17H12O6 02 黄曲霉毒素B2 Aflatoxin B2 AFB2 C17H14O6 03 黄曲霉毒素G1 Aflatoxin G1 AFG1 C17H12O7 04 黄曲霉毒素G2 Aflatoxin G2 AFG2 C17H14O7 05 赭曲霉毒素A Ochratoxin A OTA C20H18ClNO6 06 HT-2 毒素 HT-2 Toxin HT-2 C22H32O8

18、 07 T-2毒素 T-2 Toxin T-2 C24H34O9 08 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 Deoxynivalenol DON C15H20O6 09 3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 3-acetyl-deoxynivalenol 3-DON C17H22O7 10 15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯 醇 15-acetyl-deoxynivalenol 15-DON C17H22O7 11 杂色曲霉素 Sterigmatocystin ST C18H12O6 12 青霉酸 Penicillic acid PEN C8H10O4 13 伏马菌素B1 Fumonisin B1 FB1 C34H59

19、NO15 14 伏马菌素B2 Fumonisin B2 FB2 C34H59NO14 15 伏马菌素B3 Fumonisin B3 FB3 C34H59NO14 16 玉米赤霉烯酮 Zearalenone ZEN C17H22O7 17 展青霉素 Patulin PAT C18H22O5 18 黄曲霉毒素B1- 13 C17 Aflatoxin B1- 13 C17 13 C17-AFB1 13 C17H12O6 19 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 13 C15 Deoxynivalenol- 13 C15 13 C15-DON 13 C15H20O6 20 伏马毒素B1- 13 C34 Fumonis

20、in B1- 13 C34 13 C34-FB1 13 C34H59NO15 21 玉米赤霉烯酮 13 C18 Zearalenone- 13 C18 13 C18-ZEN 13 C17H22O7 DB15/T 21922021 7 附录B （规范性） 17 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的单标标准储备液和混合标准中间液的浓度 17 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的单标标准储备液和混合标准中间液的浓度见表B.1。 表B.1 17 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的单标标准储备液的浓度 序号 名称 溶剂 浓度 g/mL 01 黄曲霉毒素B1 甲醇 1.0 02 黄曲霉毒素B2 甲醇 1.0 03 黄曲霉

21、毒素G1 甲醇 1.0 04 黄曲霉毒素G2 甲醇 1.0 05 赭曲霉毒素A 甲醇 2.0 06 HT-2 毒素 甲醇 10.0 07 T-2毒素 甲醇 10.0 08 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 甲醇 50.0 09 3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 甲醇 50.0 10 15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 甲醇 50.0 11 杂色曲霉素 甲醇 2.0 12 青霉酸 甲醇 50.0 13 伏马菌素B1 甲醇 50.0 14 伏马菌素B2 甲醇 50.0 15 伏马菌素B3 甲醇 50.0 16 玉米赤霉烯酮 甲醇 50.0 17 展青霉素 甲醇 100.0 18 黄曲霉毒素B1- 13 C17 甲醇

22、 1.0 19 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 13 C15 甲醇 10.0 20 伏马毒素B 1- 13 C3 4 甲醇 10.0 21 玉米赤霉烯酮 13 C18 甲醇 20.0 DB15/T 21922021 8 17 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的混合标准中间液浓度见表B.2。 表B.2 17 种霉菌毒素及稳定同位素内标物的混合标准中间液浓度 序号 名称 溶剂 浓度 g/mL 01 黄曲霉毒素B1 甲醇 0.1 02 黄曲霉毒素B2 甲醇 0.1 03 黄曲霉毒素G1 甲醇 0.1 04 黄曲霉毒素G2 甲醇 0.1 05 赭曲霉毒素A 甲醇 0.2 06 HT-2 毒素 甲醇 1 07 T-2毒

23、素 甲醇 1 08 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 甲醇 5 09 3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 甲醇 5 10 15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 甲醇 5 11 杂色曲霉素 甲醇 0.1 12 青霉酸 甲醇 5 13 伏马菌素B1 甲醇 2 14 伏马菌素B2 甲醇 2 15 伏马菌素B3 甲醇 2 16 玉米赤霉烯酮 甲醇 5 17 展青霉素 甲醇 10 18 黄曲霉毒素B1- 13 C17 甲醇 0.1 19 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 13 C15 甲醇 5 20 伏马毒素B1- 13 C34 甲醇 2 21 玉米赤霉烯酮 13 C18 甲醇 5 DB15/T 21922021 9 附录C （资料性）

24、17种霉菌毒素及内标物的定性、定量离子对的锥孔电压、碰撞能量 17种霉菌毒素及内标物的定性、定量离子对的锥孔电压、碰撞能量见表C.1。 表C.1 17 种霉菌毒素及内标物的定性、定量离子对的锥孔电压、碰撞能量 名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞电压 V 黄曲霉毒素B1 313.1241.1 313.1284.9 313.1241.1 50 50 32 黄曲霉毒素B2 315.1259.0 315.1287.1 315.1259.0 54 24 20 黄曲霉毒素G1 329.0243.0 329.0283.0 329.0243.0 20 25 25 黄曲霉毒素G2

25、331.3189.1 331.3245.1 331.3189.1 48 36 26 赭曲霉毒素A 404.2221.1 404.2238.9 404.2221.1 20 35 25 HT-2 毒素 425.1104.8 425.1263.0 425.1104.8 24 34 12 T-2毒素 467.1244.9 467.1305.0 467.1244.9 14 8 6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 297.2203.1 297.2249.1 297.2203.1 21 6 6 3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 339.0203.0 339.0231.0 280.0192.0 20 10 20 15-乙酰

26、基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 339.0137.0 339.0321.0 343.1150.9 25 20 15 杂色曲霉素 324.9253.1 324.9309.9 324.9253.1 19 21 14 青霉酸 169.193.0 169.183.0 169.193.0 14 12 10 伏马菌素B1 722.5334.3 722.5352.3 722.5334.3 6 46 36 伏马菌素B2 706.3336.3 706.3688.4 706.3336.3 18 20 51 伏马菌素B3 706.695.1 706.6336.3 706.6336.3 18 58 34 玉米赤霉烯酮 319

27、.2187.1 319.2283.3 319.2187.1 30 6 6 DB15/T 21922021 10 表C.1 17 种霉菌毒素及内标物的定性、定量离子对的锥孔电压、碰撞能量（续） 名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞电压 V 展青霉素 152.9108.9 152.9.081.0 552.9108.9 20 13 20 黄曲霉毒素B1- 13 C17 330.1258.1 330.1301.9 330.1258.1 45 30 15 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 13 C15 354.0152.0 354.0336.0 354.0152.0 25 20 15 伏马

28、毒素B1- 13 C34 756.5368.3 756.5386.3 756.5368.3 14 38 32 玉米赤霉烯酮 13 C18 337.2205.1 337.2301.3 337.2205.1 32 16 13 DB15/T 21922021 11 附录D （资料性） 17种霉菌毒素多反应监测（MRM）色谱图 17种霉菌毒素多反应监测（MRM）色谱图见图 D.1。 图D.1 17 种霉菌毒素多反应监测（MRM）色谱图 DB15/T 21922021 12 图 D.1 17 种霉菌毒素多反应监测（MRM）色谱图（续） DB15/T 21922021 13 图 D.1 17 种霉菌毒素多

29、反应监测（MRM）色谱图（续） DB15/T 21922021 14 附录E （规范性） 17 种霉菌毒素的检出限和定量限 17 种霉菌毒素的检出限和定量限见表E.1。 表E.1 17 种霉菌毒素的检出限和定量限 名称 检出限 g/kg 定量限 g/kg 黄曲霉毒素B1 0.5 2.0 黄曲霉毒素B2 1.0 5.0 黄曲霉毒素G1 0.5 2.0 黄曲霉毒素G2 0.5 2.0 赭曲霉毒素A 3.0 5.0 HT-2 毒素 4.0 10 T-2毒素 4.0 10 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 20 50 3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 15 50 15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇 15 50 杂色曲霉

30、素 1.0 5.0 伏马菌素B1 5.0 20 伏马菌素B2 5.0 20 伏马菌素B3 5.0 20 玉米赤霉烯酮 8.0 25 青霉酸 15 50 展青霉素 25 75 DB15/T 21922021 15 附录F （资料性） 17 种霉菌毒素的添加浓度及回收率 17 种霉菌毒素的添加浓度及回收率见表F.1。 表F.1 17 种霉菌毒素添加浓度及平均回收率 序 号 名称 添加浓度 g/kg 平均回收率 % 添加浓度 g/kg 平均回收率 % 添加浓度 g/kg 平均回收率 % 01 黄曲霉毒素B1 5 88.8 50 83.4 100 89.9 02 黄曲霉毒素B2 5 85.4 50 8

31、1.3 100 87.5 03 黄曲霉毒素G1 5 86.4 50 87.3 100 95.5 04 黄曲霉毒素G2 5 95.4 50 91.8 100 87.3 05 赭曲霉毒素A 50 101 200 89.4 500 94.4 06 HT-2 毒素 100 85.4 200 85.4 500 84.3 07 T-2毒素 100 84.3 200 115.5 500 85.4 08 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 200 78.7 500 85.2 800 88.9 09 3-乙酰基-脱氧雪腐 镰刀菌烯醇 200 78.2 500 74.2 800 79.2 10 15-乙酰基-脱氧雪腐 镰刀菌烯醇

32、 200 72.1 500 81.1 800 85.4 11 杂色曲霉素 50 87.3 100 102.5 200 86.1 12 青霉酸 50 78.3 100 83.1 200 79.5 13 伏马菌素B1 100 86.1 200 89.2 500 94.2 14 伏马菌素B2 100 89.4 200 84.3 500 84.6 15 伏马菌素B3 100 72.1 200 77.3 500 82.5 16 玉米赤霉烯酮 100 101 200 95.3 500 92.4 17 展青霉素 100 70.4 200 75.1 500 79.6 注：基质为青贮玉米的17种霉菌毒素的回收率