DB13 T 2598-2017 花生品种真实性与纯度鉴定SSR法.pdf

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1、ICS 67.060 B 22 DB13 河北省 地方标准 DB13/T 2598 2017 花生品种真实性与纯度鉴定 SSR 法 2017 - 11 - 22 发布 2017 - 12 - 22 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2598 2017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人： 杨鑫雷、刘立峰、崔顺立、郭丽果 、陈焕英、穆国俊、李洪珍。 DB13/T 2598 2017 1 花生品种真实性与纯度鉴定 SSR 法 1 范围 本标准规定了利用 SSR标记对花生品种真

2、实性与纯度进行鉴定的术语和定义、原理、试剂材料、操 作程序、数据分析和判定规则。 本标准适用于利用 SSR法对花生品种真实性与纯度鉴定的试验过程。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2-1995 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4-1995 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种真实性 （ Varietal

3、Genuineness） 供检品种与文件记录 (如标签等 )是否相符。 3.2 品种纯度 （ Varietal Purity） 品种在特征特性方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表 示。 3.3 简单重复序列 SSR（ Simple Sequence Repeat） 基因组中以几个核苷酸（一般为 2个 6个）为重复单 元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序 列，又称微卫星标记。 注： 由于基本单元重复次数的不同，形成了 SSR长度的多态性。 3.4 聚合酶链式反应 PCR（ Polymerase Chain Reaction） 一种用于在体外扩增 DNA 序列的

4、技术程序。 注： 模板 DNA 经高温变性为单链，在 DNA 聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与 DNA 模板两条链上的一段互补 序列发生退火，并在 DNA 聚合酶的催化下以四种 dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底 物，使 退火引物延伸从而合成 DNA。如此变性退火和合成 DNA 反复循环，使位于两段已知序列之间的 DNA 片段呈几 何倍数扩增。 DB13/T 2598 2017 2 3.5 引物 Primer 结合在模板 DNA上的互补短链，提供 3 -OH 末端作为 DNA 合成的起点，延伸合成模板 DNA 的互补 链。 3.

5、6 核心引物 Core Primer SSR标记分析优先选用多态性高、稳定性好，识别能力强的一套引物的引物。 3.7 标准样品 Standard Sample 代表已知品种特征特性的育种家种子作为标准样品。 4 原理 花生基因组中存在着大量简单重复序列（ SSR），由于 SSR单元在不同基因型间重复次数不同，因 此同一位点的 SSR在不同品种间往往具有丰富的长度多态性。利用 PCR技术扩增每个位点的简单重复序 列，通过电泳分析其长度多态性，达到区别不同花生品种的目的。 5 试剂或材料 警示： 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺具神经毒性，配制时应注意防护。 除非另有说明，使用分析纯试剂和重蒸馏水应符合

6、GB/T 6682规定的一级水。 5.1 三羟甲基氨基甲烷（ Tris）：分子式为 C4H11NO3, CAS77-86-1。 5.2 氯化锂 (LiCl)： CAS7447-41-8。 5.3 乙二胺四乙酸二钠 盐（ EDTA Na2）：分子式为 C10H16N2O8Na2 2H2O， CAS60-00-4。 5.4 十二烷基硫酸钠 (SDS)：分子式为 C12H25NaO4S， CAS151-21-3。 5.5 聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）：分子式为 (C6H9NO)41， CAS9003-39-8。 5.6 -巯基乙醇：分子式为 C2H6OS， CAS60-24-2。 5.7 酸酚（ ac

7、id phenol pH 4.3） 。 5.8 异戊醇：分子式为 C5H12O， CAS123-51-3。 5.9 Tris 饱和酚（ pH 8.0） 。 5.10 三氯甲烷：分子式为 CHCl3， CAS67-66-3。 5.11 无水乙醇：分子式为 C2H6O， CAS64-17-5。 5.12 硫氰酸胍：分子式为 CH5N3 CHNS， CAS593-84-0。 5.13 二水柠檬酸钠：分子式为 C6H9Na3O9， CAS6132-04-3。 DB13/T 2598 2017 3 5.14 乙酸铵：分子式为 C2H7NO2， CAS631-61-8。 5.15 十二烷基肌氨酸钠：分子式

8、为 C15H28NO3 Na， CAS137-16-6。 5.16 异丙醇：分子式为 C3H8O， CAS67-63-0。 5.17 氯化钠：分子式为 NaCl， CAS7647-14-5。 5.18 氢氧化钠：分子式为 NaOH， CAS1310-73-2。 5.19 Taq DNA 聚合酶： 保存条件为 -20 2 。 5.20 四种脱氧核苷酸（ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP），缩略为 dNTPs。 5.21 硼酸：分子式为 BH3O3， CAS11113-50-1。 5.22 丙三醇：分子式为 C3H8O3， CAS56-81-5。 5.23 溴酚蓝：分子式为 C19H1

9、0Br4O5S， CAS115-39-9。 5.24 二甲苯氰 FF：分子式为 C25H27N2NaO7S2， CAS4463-44-9。 5.25 丙烯酰胺：分子式为 C3H5NO， CAS79-06-1。 5.26 甲叉双丙烯酰胺：分子式为 C7H10N2O2， CAS110-26-9。 5.27 N， N， N， N -四甲基乙二胺（ TEMED）：分子式为 C10H24N2， CAS150-77-6。 5.28 过硫酸铵：分子式为 H8N2O8S2， CAS7727-54-0。 5.29 冰醋酸：分子式为 C2H4O2， CAS64-19-7。 5.30 硫代硫酸钠：分子式为 Na2O

10、3S2， CAS7772-98-7。 5.31 硝酸银：分子式为 AgNO3， CAS7761-88-8。 5.32 甲醛溶液：分子式为 CH2O， CAS50-00-0。 5.33 1 mol/L Tris-HCl 溶液 121.1 g Tris碱溶于适量水中，加 HCl调 pH至 7.5，定容至 1L， 1.05 kg/cm2高压蒸 汽灭菌 15 min， 4贮存。 5.34 4 mol/L LiCl 溶液 称取 84.78 g LiCl置于烧杯中，加入 500 mL去离子水，搅拌溶解，室温保存。 5.35 15%(w/v) SDS 溶液 称取 15 g SDS至于烧杯中，加入 800 m

11、L的去离子水。 68加热溶解，加浓盐酸调节 pH值至 7.5，定 容至 100 mL,室温保存。 5.36 0.5 mol/L EDTA 溶液 称取 187.61 g EDTA-Na2 2H2O溶于 800 mL去离子水中，用固体 NaOH调 pH值至 7.5，定容至 1L， 1.05 kg/cm2高压蒸汽灭菌 15 min， 4贮存。 DB13/T 2598 2017 4 5.37 溶液 称取 20 g PVP溶于 500 mL去离子水中，然后加入 100 mL 1 mol/L Tris-HCl， 100 mL 0.5 mol/L EDTA， 100 mL 15 % SDS， 37.5 mL

12、 LiCl， 15 mL -巯基乙醇（用时现加），定容至 1 L， 4贮存。 5.38 氯仿：异戊醇 体积比为 24： 1。 5.39 酚：氯仿：异戊醇 体积比为 25： 24： 1。 5.40 溶液 称取 236.32 g 硫氰酸胍 , 147.05 g 二水柠檬酸钠 , 115.62 g 乙酸铵 , 10 g 十二烷基肌氨酸钠溶 于 800 mL去离子水中 , 加乙酸调节 pH值至 5.2 ，定容至 1L， 4贮存。 5.41 1.2 mol/L NaCl 溶液 称取 35.06 gNaCl溶于 500 mL离子水中，室温贮存。 5.42 70%无水乙醇溶液 5.43 加样缓冲液 称取 E

13、DTA0.88g、溴酚兰 0.05 g、二甲苯氰 FF0.05 g于烧杯中，然后加入 40 mL去离子水，加热搅 拌至充分溶解，再加入 36 mL丙三醇，加 2 mol/L NaOH调 pH值至 7.0，定容至 100 mL， 4贮存。 5.44 30%非变性聚丙烯酰胺溶液 称取 290 g丙烯酰胺、 410 g甲叉双丙烯酰胺于 烧杯中，然后加入 600 mL去离子水，室温充分溶解 , 加去离子水定溶至 1 L，过滤， 4贮存。 5.45 10%过硫酸铵溶液 10 %（ g/mL）过硫酸铵。 4贮存。 5.46 10 Tris/硼酸电泳缓冲液（ 10 TBE） 称取 108 g Tris、 7

14、.44g Na2EDTA/硼酸 55 g至于烧杯中，加去离子水溶解并定容至 1L。 1.05 kg/cm2 高压蒸汽灭菌 15 min， 4贮存。 5.47 1% 硫代硫酸钠 1 %（ g/mL）硫代硫酸钠。室温贮存。 5.48 固定液 其中含 10 %（体积比）无水乙醇和 0.5 %（体积比）冰乙酸，既用即配。 5.49 染色液 0.2 %（ g/mL） AgNO3，即用即配。 5.50 显影液 其中含 1.5 %（ g/ml） NaOH和 0.4 %（体积比）甲醛，即用即配。 DB13/T 2598 2017 5 6 仪器设备 6.1 PCR 扩增仪： 96 孔， 0.2 mL。 6.2

15、高速冷冻离心机：最大离心力 12,000 g。 6.3 电泳检测系统：垂直电泳系统 。 6.4 微量移液器：规格分别为 2 L、 10 L、 20 L、 100 L、 200 L、 1000 L，连续可调 。 6.5 低温冰箱：最低温度 -20 。 6.6 高压灭菌锅： 120 2 。 6.7 电子天平：精确度 0.001 g。 6.8 恒温水浴锅：温控精确度 1 。 6.9 脱 色摇床：圆周振荡 。 6.10 磁力搅拌器 。 6.11 微波炉 。 6.12 胶片观察灯 。 6.13 酸度计：精度 0.01 pH。 6.14 垂直振荡仪 。 6.15 紫外分光光度计（ 230 nm、 260

16、nm、 280 nm） 。 7 样品 受检样品种子重量为 1000 g，随机选取大小均一、健康饱满的种子 100粒，重复 3次，按 GB/T 3543.4-1995进行发芽试验，其余种子置于塑封袋中常温或 4保存。 7.1 扦样 受检样品的扦样和分样应按 GB/T 3543.2-1995的规定执行。 7.2 样品制备 从受检样品中随机抽取 5粒种子为一组，磨碎混匀，制成至少 6个混样样本，分别提取基因组 DNA （见附录 B），也可使用商业化的 DNA提取试剂盒。以受检样品所标注品种的标准样品作为对照。 7.3 样品保存 受检样品应至少保存 1年或花生整个生长季，以备复验。 8 试验步骤 8.

17、1 PCR 反应及程序 DB13/T 2598 2017 6 PCR反应及程序见附录 C。 8.2 聚丙烯凝胶电泳 PCR产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（见附录 D）检测。 9 试验数据处理 9.1 花生品种纯度的计算 随机选择不少于 100粒受检样品的种子，由核心引物中选取 10对引物对受检样品进行电泳，依据电 泳谱带的特征和一致性，计数供检样品总数和非本品种特异谱带粒数，并按下列公式计算电泳测定值 （品种纯度） P。 1 0 0( % ) 供检样品总粒数 非本品种特异谱带粒数供检样品总粒数受检品种纯度 P （ 1） 式中： P 品种纯度； 计算结果保留两位小数。 9.2 花生品种真实性判

18、定 首先利用附录 A中的 57对核心引物对受检样品和标准对照混样样本 DNA进行扩增。 PCR扩增反应体系 及程序见附录 C， PCR产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（见附录 D）检测。 其次，根据受检样品与标准对照混样样本 DNA电泳谱带的异同，判定受检样品的真实性，若在所检 测的 57对核心标记中： a) 受检样品与标准对照样本差异标记数 4，判读为不同品 种； b) 受检样品与标准对照样本差异标记数 1 或 2，判读为近似品种； c) 受检样品与标准对照样本差异标记数 0，判读为相同或极近似品种。 10 试验报告（见附录 E） DB13/T 2598 2017 7 附 录 A （资料性附

19、录） SSR 标记信息 表 A.1 SSR 标记信息 编号 标记 名称 上游引物 下游引物 1 AHGS1357 ATGGAGAATAACCAATGGCG ATCAAAGCGGAACACACACA 2 AHS1661 CAAAACTTCGAGCTCTTGCC CTCAGTTGCAGGCTAATGACA 3 Seq3A08 ATACGTGACTTGGGCCAGAC AGTGAAAAATACACCCAACGAA 4 TC42A05 GAACATGAAGGGACACACACAT AGAGAAGCTGGTTGGGTTGTAA 5 AHGS1171 CAAACAGCTCGTCGATTGAA ACGGGC

20、TAACCCGATTAGAT 6 AHGS1197 CAAACAAAGCCCAAAGGAAA TGGACATTGCTTTTCTTGATTG 7 AHGS1214 GCTTCATTGAGATTGGGGAA CAGTTCTCAATAACAGAACCAGC 8 AHGS1241 GCTAAGCTAAATTACCCATTTTGTG GTTTGAGCTTGTGCAGTGGA 9 AHGS1251 GGATTCGGTGAAACGACACT GATGCCCTTTCTTCATCCAA 10 AHGS1278 GGAGCAGAATTCAGTTCATTTACA ACTGGAGCCTATTCTTCGCA 11 AH

21、GS1286 CCCTCCAATCTTCTTCCCTC TTCAACCTCTTCGCTCTACCA 12 AHGS1329 CACATTAGTGAGTTTTTCCCCC AAAGGCTAATTGTTTAATTTTACTGC 13 AHGS1342 CTGCATAGTGGCGGTGATAA CATCGGATTAATTCAACGGT 14 AHGS1382 TTCCTGTGCCTTTTGGATTC CGAGATGAAGGTGGTGAGGT 15 AHGS1385 TCCCTTTGCTTGTTACCACA AATTTTGAAAGCGGGCATAA 16 AHGS1394 CGCCCAGGCTTATA

22、GTGAAG ATCCTCACCCCGAGTCTTCT 17 AHGS1510 CCAGCCATAACCAACATCCT CAGCATGGATGACGTAGTGG 18 AHGS1573 TTCTTGGTTGAAATGACCCC GCTTACCACAGGTAAACCATCC 19 AHGS1594 CCGGCAGAACACTCTCTCTC GCGAGATAACTGCATCAGCA 20 AHGS1684 ATGGCAATGACAAGACACGA CGATGGTAACGAGCCCTAAA 21 AHGS1692 CCAAAACAAAGCAAAGGGAA ATCCCAACGAGACCACTCAG

23、22 AHGS1754 AAGTTGTTTGGAAAACCCCC CGATTTGTTCTTGCATGTGG 23 AHGS1790 GGACGATAGCAACATCAGCA GGGCTAAATTCAAACGCAAA 24 AHGS1886 TTCCTTTGAGCCTTTGCACT TGCTAATGAGGATCCATTGCT 25 AHGS1940 AACTCCGCGCCTATGTTCTA GGGAGAGGATGATGGTGGTA 26 AHGS1969 CCACTGTTTCGTTCCCTCAT GATTCAAACGAAACCGCATT 27 AHGS2108 AGCACTAGCCGAGTCCA

24、TGT CGTCGGATTTACTGACGGAT 28 AHGS2782 ATGCGGAACTCCACAATTTC TGACGTCGAGTTCATCAAGC 29 AhM086 GTGAAATTCTTCCCCGCATA TGCCTGTTGCCTACAGAAGA 30 AHS0049 TGCTTCTTCTCTCTGTCGCA GCCAGAACTGAGGGTGGATA 31 AHS0941 CATTGGAAGCAAATCAGCAA CACCCTAATTCCCCCAAGTT 32 AHS1480 TGGGCTCCAACAATACAACA TGTGTACAGGCATCATCGGT DB13/T 259

25、8 2017 8 表 A.1 SSR 标记信息 (续 ) 编号 标记 名称 上游引物 下游引物 33 EE16 ATGGGACCACGAACATTTGA GAGCACGTTCAAGCACTCATT 34 Seq14H06 GCAACTAGGGTGTATGCCGT CAACCCTATACACCGAGGGA 35 GM2259 GGAAGCACCGATAGTTCCTCT TTCTGCTGCTTTCACTCATCA 36 GM2388 GTGAGGAGCATCTTGTGTGGT GAACTTCTTGCAAGGGAACAA 37 seq3B5 CCTCCCTGCTTGATCCAATA AACTGTAG

26、CGAATGTGTTACATGG 38 GM1867 GAGCAGACATGGTTGAATGGT CACCTCAACGAAGAACTCAGC 39 GM1135 ACCAGGAAACCCACCAGTTAG CAACCCAAGTTTTGAACCTCA 40 GM1907 CACTGTCCTCTTCCCTCACTCT GGTGGACGAAGAAGAAGAAGAA 41 GM1641 ACACGTGTCCCTCAAACACA GTTGCAGAGCTCATCAAGCA 42 GM2536 AGCCTCCACCTTCTCCTATTG GATGCAGTGGAGGGATAACAA 43 GM1573 GAG

27、ACCGGAGACGGAGAGTAT ACGCCCATAGATTAACCCAGT 44 GM625 CCTCACTTCTTTTTGCATGGT TGGAAAGGAAATGATTTGGTG 45 GM2536 AGCCTCCACCTTCTCCTATTG GATGCAGTGGAGGGATAACAA 46 AHGS1127 CGTCGGAAATATCCGTCTGT CTGCACTCATCCCCTTCATT 47 AHGS1296 GAGGTATGGCGTCGTTTGAT GTGTTGCAAACACCTCCCTT 48 AHGS1692 CCAAAACAAAGCAAAGGGAA ATCCCAACGAG

28、ACCACTCAG 49 pPGPseq7G2 ACTCCCGATGCACTTGAAAT AACCTCTGTGCACTGTCCCT 50 PM375 CGGCAACAGTTTTGATGGTT GAAAAATATGCCGCCGTTG 51 GM1890 CTCTCCGATTATAGGCCAACC TGGCTTCTCCGTGAAAATAAC 52 GM1954 GAGGAGTGTGAGGTTCTGACG TGGTTCATTGCATTTGCATAC 53 GM635 TTGTGCGAAGGGTAAGATAGAAA TCCTGTGCTTGAATCTGGAAT 54 GM1996 CATCCCATCAT

29、TTTCCCTCTT TACAGTGAAGGTGGGATCCTG 55 GM660 TGAAAGTAACTCGTTTACAGTTTGAAG TCACTAAACATGTGGGTAACTAAGAAA 56 GM694 ATTTGTGCCCTACCACCTTCT TCCCTCCTAGAGGTTGACTTGA 57 GM2067 TCGCCAAGAAGAACAAAACAC CTGGTCGAAGAAGGGTTCTCT 注： 57 对核心引物序列信息 DB13/T 2598 2017 9 附 录 B （规范性性附录） 花生种子基因组总 DNA 提取方法 B.1 取干花生种子 1 g 1.2 g，去种皮，放

30、入研钵中，加液氮研磨至粉末状，转入 40 mL 离心管中。 B.2 加入 10 mL 溶液（见 5.37），充分混匀。 B.3 加入 5 mL pH4.3 的酸酚（见 5.7）充分混匀 5 min。 B.4 加入 5 mL 氯仿：异戊醇（见 5.38），混匀 5 min。 B.5 12000 g， 4 10 ，离心 10 min，吸取上清 9 mL，转移到含有 9 mL pH 5.2 溶液 II（见 5.40） 的 40 mL 离心管内，室温缓慢震荡 10 min。 B.6 加 4.5 mL 酚：氯仿：异戊醇（见 5.39），充分混匀 5 min。 B.7 12000 g，离心 10 min，

31、吸取 16 mL 上清，置于 40 mL 离心管内。 B.8 加入 9 mL 1.2 M NaCl 和 9 mL 异丙醇，混匀，冰浴 1 h。 B.9 12000 g，离心 15 min，弃上清，沉淀用 2 mL 冰 70 %乙醇洗涤，过夜干燥。 B.10 加入 4 mL 超纯水溶解，再加入 4 mL 4 M LiCl，混匀，冰浴 1 h。 B.11 12000 g， 4，离心 15 min。 B.12 取 8 mL 上清转移到 40 mL 离心管中，加入 8 mL 异丙醇，混匀， 12000 g， 4，离心 15 min。 B.13 弃上清，沉淀用 2 mL 冰 70 %乙醇洗涤两次，干燥，

32、加入 200 L 超纯灭菌水溶解后备用。 B.14 利用紫外分光光度计（见 6.15）测定 DNA 浓度。取提取的 DN A 溶液 5 L，加水 995 L，放 人比色杯中， 用紫外分光光度计检测，记下 260 nm 和 280 nm 下的 OD 值，计算出 DNA 的浓度以及 OD260/OD280 的比值。 DNA 的 OD260/OD280 最好在 1.7 1. 8 左右。 DB13/T 2598 2017 10 附 录 C （规范性附录） PCR 反应及程序 C.1 PCR 扩增反应体系 PCR扩增反应体系见表 1。 表 C.1 推荐反应体积（ 10 L） 反应组分 原浓度 终浓度 体

33、积（ L） 10 PCR 缓冲液 10 1 1.0 dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.2 Taq 酶 5.0 U/L 0.1 U/L 0.2 上游引物 10 mol/L 0.5 mol/L 0.5 下游引物 10 mol/L 0.5 mol/L 0.5 受检样品 DNA 15 ng/ L 30 ng/ L 2.0 超纯水（ DNA free） - - 5.6 C.2 PCR 扩增反应程序 起始 94变性 5 min； 55复性 35个循环 (94 1 min， 55 30 s， 72 45 s)； 72延伸 10 min； 4保存。 DB13/T 2598 2017 1

34、1 附 录 D （规范性附录） 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 D.1 电泳样品准备 在 PCR扩增产物中加入 2 L加样缓冲液，充分混匀。 D.2 凝胶制备 玻璃板处理：用自来水清洗平、凹玻璃板，用去离子水冲洗干净后晾干。 玻璃板安装：将玻璃板平放在调平的架子上，再用 75% 的酒精擦拭玻璃板 2次 3次，最后将擦好 的凹板盖到平板上。分别在玻璃板的左右两侧加上夹力大小相同的夹子，调节夹子的位置，插入梳子， 使梳子插入的容易度适中。 凝胶配制：量取 25.1 mL ddH2O， 10TBE 4 mL， 30 %丙烯酰胺 凝胶原液 10.6 mL置于灌 胶瓶中，摇 晃均匀，再加入 26 L T

35、EMED， 10 %AP 560 L，充分摇匀后，立即灌胶，灌胶后及时插入梳齿。 D.3 预电泳 胶凝固后加入 1 TBE电泳缓冲液，下面的液面应超过电泳槽底部凸起的台子并漫过铂金丝，中间 的液面应超过内侧的玻璃板上缘（电泳缓冲液可反复使用多次，每周更换一次）。拔出梳齿。 200 V 恒压，预电泳 10 min 30 min。 D.4 电泳 用移液器冲洗胶孔，清除气泡和杂质，每孔加样 1 L 2 L，在不同位置的胶孔中加入 DNA marker， 来判断电泳条带的大小和区别胶 板。 200V 250 V恒压，电泳 45 min 60 min，二甲苯氰 FF电泳到中部 即可。 D.5 拆胶 关闭

36、电源，取下玻璃板，将两块玻璃板轻轻撬开，将凝胶从玻璃板上剥离。 D.6 固定： 将凝胶浸入固定液中，置于摇床上摇动固定，不超过 10 min（固定液的量可根据胶板数量和大小 调整，以没过胶面为准）。 D.7 漂洗： 用适量 ddH2O 快速漂洗，约 6 min。 D.8 银染： 在新配制的染色液中摇动染色， 3 min 5 min。 D.9 漂洗： 用适量 ddH2O 快速漂洗凝胶，时间不超过 15 s。 D.10 显影： 在新配制的显影液中摇动直至显出清晰的条带。 D.11 漂洗： 将显影后的凝胶转至自来水中漂洗 5 min 10 min。 D.12 记录： 可用数码相机照相或在胶片观察灯上

37、直接记录结果。 DB13/T 2598 2017 12 附 录 E （规范性附录） 河北农业大学农学院检验报告 NO： 2018 河北农业大学农学院 检验报告 产品名称： _ 送检单位： _ 检验类型： _ 检 验 员： _ 本报告共 三 页 报告编制日期： 年 月 日 第 1页 DB13/T 2598 2017 13 注 意 事 项 一、报告无“检验专用章”和“检验单位公章”无效。 二、复制报告未加盖检验单位公章无效。 三、报告无检验（制表）、审核、批准人签字无效。 四、报告涂改无效。 五、对检验报告若有异议，应于收到报告之日起十五日内向检验单 位提出，逾期不再受理。 六、被（送）检单位对提供信息的真实性负责，检验机构对该样品 的检测数据负责。 第 2 页 DB13/T 2598 2017 14 农作 物种子检验机构检验报告 NO： 2018 作物种类 品种亲本 品种名称 商标 被检单位 检验项目 所使用的标准（包括发布或出版年号） 所使用的方法 检验结果： 检验结论： 检测 单位公 章 年 月 日 批准： 审核： 检验（制表）： 第 3 页 _