CNS 12980-2007 Method of test for milk and milk products - Determination of nitrate and nitrite content in edible cheese《乳品检验法－食用干酪硝酸盐和亚硝酸盐含量之测定》.pdf

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1、 1 印月 96 1 月 本標準非經本局同意得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 號 ICS 67.100 N623612980經濟部標準檢驗局印 公布日期 修訂公布日期 81 4 月 20 日 96 1 月 19 日 (共 7 頁 )乳品檢驗法食用乾酪硝酸鹽和亞硝酸鹽含量之測定 Method of test for milk and milk products Determination of nitrate and nitrite contents in edible cheese 1. 適用範圍：本標準規定食用乾酪中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量之測定法。本標準使用鎘還原法，適用於各種硬型、半硬

2、型和軟型乾酪、乾酪加工製品以及乳清乾酪。 2. 原理：將乾酪 用溫水萃取，使脂肪和蛋白質沉澱且過濾。藉銅化鎘 (copperized cadmium)將部分濾液中硝酸鹽離子還原成亞硝酸鹽離子。在未還原和已還原濾液中，加入 sulfanilamide 和 N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride，使呈紅色反應，並在波長 538 nm 下測定吸收值。以一系列亞硝酸鈉標準溶液濃度和吸收值的關係，計算試樣中亞硝酸鹽含量及硝酸鹽離子被還原後的總亞硝酸鹽含量，此兩者結果之差即為硝酸鹽之含量。其量各以 mg NO3/kg 及 mg NO2/kg 表示。 3. 檢

3、驗方法 3.1 裝置、器具及材料：玻璃器具應用蒸餾水徹底洗乾淨，以確保無任何 NO2及NO3殘留。 3.1.1 分析天平：精確至 0.0001 g。 3.1.2 研磨裝置。 3.1.3 適當實驗室型混合機或均質機，其玻璃容器有 250 至 400 mL 之容量。 3.1.4 圓錐形瓶： 250、 500 及 1000 mL。 3.1.5 容量瓶： 100、 500 及 1000 mL。 3.1.6 吸管： 2、 4、 5、 6、 8、 10、 12、 20 及 25 mL，可用滴定管 (burettes)替代。 3.1.7 量筒： 5、 10、 25、 100、 250、 500 及 1000

4、 mL。 3.1.8 玻璃漏斗：直徑約 7 cm，短頸。 3.1.9 濾紙：中級，直徑約 15 cm，不含硝酸鹽與亞硝酸鹽。 3.1.10 還原管柱 (見附圖 )。 3.1.11 分光光度計：可測 538 nm 波長之吸光值，其比色管之光徑長 (optical path length)為 1 至 2 cm。 3.2 試藥：所有試藥必須是分析級，且所 用水必須為不含硝酸鹽及亞硝酸鹽之蒸餾水或去離子水。 備考： 為了儘可能防止有小氣泡存在銅化鎘之管柱 (第 3.1.10 節 )中，在製備 (第3.3.2.1 節 )管柱、檢測管柱還原能力 (第 3.3.2.2 節 )及再生管柱 (第 3.3.2.3

5、節 )中所使用的蒸餾水或去離子水，最好是新煮沸的並冷卻至室溫者。 3.2.1 鎘粒 (直徑 0.3 0.8 mm)，假如鎘粒沒有商業化的產品，可以下列方法製備，取適量之鋅棒置於燒杯中，用 40 g/L 之 CdSO48H2O 溶液覆蓋 24 小時， 2 CNS 12980, N 6236 並時常把鋅棒上海棉狀的鎘刮下 來。移去鋅棒並倒出浸覆溶液，只留下足夠蓋住海綿狀的鎘，用蒸餾水洗滌 2 至 3 次後移至攪拌機中，並加入 400 mL 0.1 M HC1 溶液均勻攪拌數秒鐘，得到適當大小之顆粒，再倒入燒杯中並靜置數小時，偶而攪拌以去除氣泡，緩慢倒出浸覆溶液並立即依第 3.3.2.1 節之步驟銅

6、化 (copperize)之。 3.2.2 硫酸鎘溶液 c(CdSO48H2O)= 40 g/L。稱取 40 g 硫酸鎘溶於水中並稀釋至1000 mL。 3.2.3 硫酸銅溶液：稱取硫酸銅 (CuSO45H2O)20 g 溶於水中，並稀釋至 1000 mL。 3.2.4 緩衝溶液： (pH 9.6 9.7)取濃氫氯酸 50 mL比重 1.19，約 38% (m/m)溶液加水 600 mL，混勻後加氨水溶液 NH4OH(比重 0.91， 25%氨水加水稀釋至1000 mL)135 mL，且均勻混合。必要時調 pH 9.6 9.7。 (若無現成 25% NH4OH，則可用適量之高濃度 NH4OH

7、溶液調配， 20為 0.88)。 3.2.5 氫氯酸溶液： (約 2 M)取濃氫氯酸 1160 mL(20為 1.19)，用水稀釋至 1000 mL。 3.2.6 氫氯酸溶液： (約 0.1 M)取第 3.2.5 節之氫氯酸溶液 50 mL，用水稀釋至 1000 mL。 3.2.7 使蛋白質及脂肪沉澱之溶液 3.2.7.1 硫酸鋅溶液：稱取硫酸鋅 (ZnSO47H2O) 53.5 g 溶於水，並用水稀釋至 100 mL。 3.2.7.2 亞鐵六氰化鉀 (potassium hexacyano ferrate(II)溶液：稱取亞鐵六氰化鉀 (K4Fe(CN)63H2O)17.2 g 溶於水，並用

8、水稀釋至 100 mL)。 3.2.8 EDTA(disodium ethylene diamine tetraacetate dihydrate)溶液：稱取二鈉鹽四醋酸乙二胺結晶（ Na2C10H114N2O82H2O） 33.5 g 溶於水，並用水稀釋至1000 mL。 3.2.9 發色溶液 3.2.9.1 溶液 ：稱取硫酸胺 (sulfanilamide； NH2C6H4SO2NH2)0.5 g 加水 75 mL 和濃氫氯酸 1(20=1.19)5 mL，在沸水浴中加熱溶解並混勻後冷卻至室溫，並用水稀釋至 100 mL。必要時應予以過濾。 3.2.9.2 溶液 ：稱取濃氫氯酸 (20=1

9、.19)450 mL 溶於水並用水稀釋至 1000 mL。 3.2.9.3 溶液 ：稱取 (N 1 naphyl ethylenediamine dihydrochloride； C10H7NHCH2CH2NH22HC1) 0.1 g 溶於水並用水稀釋至 100 mL。必要時應予以過濾。本溶液裝在褐色瓶內，在冰箱中可保存 1 週。 3.2.10 亞硝酸鈉 (NaNO2)標準溶液：相當於 0.001 g/L NO2，於使用當天配製，取在 110 120 乾燥過的亞硝酸鈉 0.15 g 溶於水並用水稀釋至 1000 mL，混勻。取 10 mL 加入 (第 3.2.4 節 )所配製之緩衝溶液 20

10、mL，再用水稀釋至 1000 mL 並混勻。此標準溶液每 1 mL 含有 1 g NO2。 3.2.11 硝酸鉀 (KNO3)標準溶液：相當於 0.0045 g/L NO3，於使用當天配製，取在110 120 乾燥過的硝酸鉀 1.468 g，溶於水並用水稀釋至 1000 mL 並混 3 CNS 12980, N 6236 勻。取 5 mL，加 入 (第 3.2.4 節 )所配製之緩衝溶液 20 mL，再用水稀釋至 1000 mL 並混勻，此標準溶液 1 mL 含有 4.50 g NO3。 3.3 步驟 3.3.1 試樣製備：先把乾酪外表層刮去 ，使真正代表消費者食用之乾酪試樣，用適當裝置磨碎並

11、立即混勻，若可 能，再磨碎及充分混合一次。每次磨碎試樣後，清洗磨碎裝置。若試樣不 能磨碎，則以連續密集的揉捏混勻。把磨碎過的試樣立即移入不透氣容器 中待分析。分析應儘早，若須延遲，則試樣應適當的保存，且避免容器內部水分的凝結。 3.3.2 測定 3.3.2.1 銅化鎘管柱製備 3.3.2.1.1 把鎘粒 (第 3.2.1 節 )約 40 60 g 置於圓錐瓶 (第 3.1.4 節 )。 3.3.2.1.2 加適量氫氯酸溶液 (第 3.2.5 節 )覆蓋鎘粒，以漩渦式攪拌數分鐘。 3.3.2.1.3 小心去除覆蓋溶液後，用水沖洗鎘粒直至無氯離子存在。 3.3.2.1.4 鎘粒 1 g 約加硫酸銅

12、溶液 (第 3.2.3 節 )2.5 mL，以漩渦式攪拌 1分鐘。 3.3.2.1.5 小心去除上層之溶液，並立即以水洗淨，注意應使水一直覆蓋鎘粒，一直至洗出之水中無沉澱的銅為止。 3.3.2.1.6 將玻璃綿栓填入玻璃管柱底部 (見附圖 )，並使管柱中充滿水。 3.3.2.1.7 將已銅化之鎘移入玻璃管柱，儘量使已銅化的鎘粒不要曝露在空氣中，銅化鎘在管柱之高度約 15 20 cm。 備考 1. 製備時要避免銅化鎘管柱中有氣泡存在。 2. 須極小心不使銅化鎘露出液外。 3.3.2.1.8 為維持新製備的管柱能在最好狀態，用下面之混合溶液處理之，此混合液混合了水 750 mL，硝酸鉀標準溶液 (

13、第 3.2.11節 )225 mL，緩衝溶液 (第 3.2.4 節 )20 mL 及 EDTA 溶液 (第 3.2.8節 )20 mL。其流速不超過 6 mL/min，再用水 50 mL 洗管柱。 3.3.2.2 管柱還原能力的檢查：開始使用和結束 時各檢查一次，亦即一天要檢查 2 次。 3.3.2.2.1 吸取硝酸鉀標準溶液 (第 3.2.11 節 )20 mL 到管柱上端之貯蓄槽，並立即加入緩衝溶液 (第 3.2.4 節 )5 mL，收集濾液至 100 mL定量瓶中，其洗出流速不超過 6 mL/min。 3.3.2.2.2 當管柱上端之貯蓄槽快流盡時，用水 15 mL 洗貯蓄槽壁，流盡後再

14、用水 15 mL 水洗。最後以水充滿，並以最大流速通過管柱。 3.3.2.2.3 當收集液快至 100 mL 時，移開定量瓶，並用水定量至 100 mL。 3.3.2.2.4 吸取收集液 10 mL 至另一個 100 mL 定量瓶中，加水至約 60 mL，然後依 (第 3.3.2.7.2 節 )(第 3.3.2.7.3 節 )和 (第 3.3.2.7.4 節 )步驟行之。 3.3.2.2.5 從 (第 3.3.2.9 節 )檢量曲線定量出濾液稀釋後的亞硝酸鹽含量， 4 CNS 12980, N 6236 由此可再計算出管柱還原能力百分比 (100%還原能力相當於0.067 g NO2/mL)，

15、如果還原力低於 95%，則本管必須再生。 3.3.2.3 管柱的再生：每天使用結束時，應使管 柱再生，若發生效率減低時，則再生之次數需增加。 3.3.2.3.1 吸取 EDTA 溶液 (第 3.2.8 節 5 mL)及氫氯酸溶液 (第 3.2.6 節 )2 mL 再加入水 100 mL 混勻，以流速 10 mL/min 流洗管柱。 3.3.2.3.2 當快流盡時，先用水洗，次用氫氯酸溶液 (第 3.2.6 節 )清洗管柱，最後再用水洗管柱。 3.3.2.3.3 如果還原力不佳，須重覆第 3.3.2.1.8 節的步驟。 3.3.2.4 測試樣品量：精確稱取已磨碎乾酪試樣 (10.00 0.01)

16、g(乳清乾酪 5.00 0.01 g)至混合機或均質機 (第 3.1.3 節 )的玻璃容器中。 3.3.2.5 萃取和去除蛋白質 3.3.2.5.1 慢慢加入溫水 144 mL(50 55 )( 乳清乾酪為加入 134 mL溫水 )於上述樣品後，用均質機或混合機均勻混合直至乾酪充分懸浮。 3.3.2.5.2 再依序加入硫酸鋅溶液 (第 3.2.7.1 節 )6 mL，亞鐵六氰化鉀 ()溶液 (第 3.2.7.2 節 )6 mL，緩衝溶液 (第 3.2.4 節 )40 mL 至乾酪懸浮液中，每加一樣溶液應予以混勻。 3.3.2.5.3 靜置 3 分鐘後用濾紙過濾，以 250 mL 圓錐瓶收集濾液

17、。 (濾液須清澈。假如樣品是熟成型乾酪，則沉澱反應劑的使用量要增加，而 (第 3.3.2.5.1 節 )使用的溫水應同量減少。 ) 3.3.2.6 硝酸鹽還原成亞硝酸鹽 3.3.2.6.1 吸取濾液 (第 3.3.2.5.3 節 )20 mL 至還原管上端貯蓄槽，加入緩衝溶液 (第 3.2.4 節 )5 mL，用 100 mL 定量瓶收集濾液，流速不超過6 mL/min。 3.3.2.6.2 當貯蓄槽快流盡時，用水 15 mL 洗貯蓄槽壁，流盡後再水洗一次。當第二次水洗快流盡時，用水充滿貯蓄槽，並用最大流速通過管柱。 3.3.2.6.3 當收集濾液近 100 mL 時，移開定量瓶用水稀釋至 1

18、00 mL 並混合均勻。 3.3.2.7 測定 3.3.2.7.1 吸取適量濾液 (第 3.3.2.5.3 節 )約 5 40 mL 至 100 mL 定量瓶中，俾進行亞硝鹽測定。吸取適量濾液 (第 3.3.2.6.3 節 )約 5 至40 mL 至另一 100 mL 定量瓶中，俾進行硝酸鹽測定，每一定量瓶加水至 60 mL 體積。 3.3.2.7.2 加入溶液 ( 第 3.2.9.2 節 )6 mL，溶液 ( 第 3.2.9.1 節 )5 mL，小心混合均勻，在室溫下放置 5 分鐘並避免陽光直射。 3.3.2.7.3 加入溶液 ( 第 3.2.9.3 節 )2 mL，小心混勻，在室溫下放置

19、5 分鐘並避免陽光直射，用水定量至 100 mL 並混勻。 5 CNS 12980, N 6236 3.3.2.7.4 在 15 分鐘內測定波長 538 nm 之吸光值，並以空白試驗 (第3.3.2.8 節 )作比較。 3.3.2.8 空白試驗：除了不加試樣外，使用相同的試驗步驟及試劑。 3.3.2.9 檢量線各取 0， 2， 4， 8， 12 和 20 mL 的亞硝酸鈉標準溶液 (第 3.2.10節 )至各個 100 mL 容量瓶中，各加水至約 60 mL。依 (第 3.3.2.7.2 節第 3.3.2.7.3 節 )的步驟處理。於 15 分鐘內測定波長 538 nm 之吸光值，並與空白試驗

20、作一比對。畫出吸光值與 亞硝酸鹽濃度之關係圖。濃度以 g/mL 表示。可由所加之亞硝酸鹽標準溶液量來決定亞硝酸鹽量。 3.4 計算 3.4.1 亞硝酸鹽含量 (mg NO2/kg) =vmc20000式內， c：使用 (第 3.3.2.5.3 節 )濾液的吸光值 (第 3.3.2.7.4 節 )經過檢量線求出之亞硝酸鹽濃度 (g/mL)。 m：稱取試樣重 (g)。 v：由第 3.3.2.6.3 節濾液中所取出的體積 (第 3.3.2.7.1 節 )(mL) 3.4.2 硝酸鹽含量 1(mg NO3/kg) =vmc1000002 W(NO2) 1.35 式內， c2：使用 (第 3.3.2.7

21、.1 節 )濾液吸光值，經過檢量線求出亞硝酸鹽濃度，(g/mL)。 W(NO2)：由第 3.4.1 節中求出之亞硝酸鹽含量 (mg/kg)。 m：稱取試樣重 (g)。 v：從第 3.3.2.6.3 節濾液中所取出體積 (第 3.3.2.7.1 節 )， (mL)。 備考：若考慮管柱的還原能力，則公式應修正如下： NO3(mg/kg)=vmc1000002r100 W(NO2) 1.35 管柱經一連串使用後最後的還原力。 3.5 注意事項 3.5.1 本方法的精密度 3.5.1.1 重複性 (repeatability) 3.5.1.1.1 亞硝酸鹽在短時間內由同一檢驗員重複做兩次，其結果差異不

22、應超過 1 mg/kg。 3.5.1.1.2 硝酸鹽在短時間內由同一檢驗員重複做兩次，對乾酪而言，若硝酸鹽含量小於 30 mg/kg，其結果差異不應超過 3 mg/kg，若硝酸鹽含量等於或大於 30 mg/kg 時，其結果差異不超過其算術平均數的 10%。對乳清乾酪而言，若硝酸鹽含量小於 30 mg/kg，其結果差異不應超過 5 mg/kg，若硝酸鹽含量等於或大於 30 mg/kg 時，其結果差異不超過其算術平均數的 15%。 3.5.1.2 再現性 (reproducibility)：不同實驗室，不同操作者，分析同一樣品，其分別獲得的結果，對乾酪而言，若硝酸鹽含量小於 30 mg/kg 時，

23、其 6 CNS 12980, N 6236 差異應不超過 6 mg/kg。若硝酸鹽含量大於 30 mg/kg 時，其差異應不超過其算術平均數的 25%。對乳清乾酪而言，若硝酸鹽含量小於 30 mg/kg 時，其差異應不超過 10 mg/kg。若硝酸鹽含量大於 30 mg/kg 時，其差異應不超過其算術平均數的 15%。 3.5.2 本標準之偵測極限：硝酸鹽 5 mg/kg、亞硝酸鹽 0.5 mg/kg。 3.5.3 本標準之操作含有毒物質之使用 ，使用者在操作前應制定合適的安全規範並小心操作。 3.5.4 鎘粒具有毒性，用過的鎘粒依化學廢棄物處理原則處理。 3.5.5 例行分析亦 可採用分隔流

24、動分析法 (segmented flow analysis)或流動分析系統 (flow injection analysis (FIA)進行分析。 相對應國際標準 ISO 14673-1, 2004, Milk and milk products Determination of nitrate and nitrite contents Part 1： Method using cadmium reduction and spectrometry ISO 14673-2, 2004, Milk and milk products Determination of nitrate and nit

25、rite contents Part 2： Method segmented flow analysis (Routine method) ISO 14673-3, 2004, Milk and milk products Determination of nitrate and nitrite contents Part 3： Method using cadmium reduction and flow injection analysis with in line dialysis(Routine method) 7 CNS 12980, N 6236 圖 1 硝酸鹽還原管柱 螺栓 玻璃棉栓