DB37 T 420.2-2004 海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程 第2部分_扫描电镜诊断法.PDF

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1、 DB37/T 420.2-2004 1 ICS 65.150 DB37 B 51 山东省地方标准 DB37/T 420.2-2004 海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程 第二部分：扫描电镜诊断法 2004-12-14 发布 2005-01-01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 420.2-2004 I 前 言 本标准由山东省海洋与渔业厅提出。 本标准由山东省渔业标准化专业技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省海水养殖研究所。 本标准起草人：李天保、叶海斌、刘恩孚、朱安成、吴志宏。 DB37/T 420.2-2004 1 海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程 第二部分：扫描电镜诊断

2、法 1 范围 本标准规定了指状拟舟虫病扫描电镜诊断所需试剂与材料、操作步骤和结果判定。 本标准适用于海水养殖鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、真鲷等养殖鱼类品种，感染指状拟舟虫情况的筛 选和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682-92分析实验室用水规格和实验方法。 3 指状拟舟虫病的病理学特性 指状拟舟虫是海水鱼类养殖过程中引发寄生虫疾病的主

3、要寄生虫之一。感染指状拟舟虫可导致鱼类 肌肉组织及脑组织严重病变、坏死，并大量寄生于循环系统中吞噬血细胞，导致贫血。感染初期，在鱼 的体表以及口腔粘膜等处发生溃烂，严重时侵入鱼体内，常继发感染致病性细菌导致鱼类死亡率增高。 4 试剂和材料 若非注明，本标准使用确认为分析纯的试剂。 所用水若非注明应符合GB/T6682-92规定。 Na2HPO42H2O。 NaH2PO42H2O。 戊二醛。 30%乙醇。 50%乙醇。 70%乙醇。 80%乙醇。 90%乙醇。 无水乙醇。 过滤海水：盐度为2030的海水在室内放置一周后，经滤纸和0.22m滤膜过滤。 磷酸盐缓冲液按附录A的规定。 磷酸缓冲戊二醛按

4、附录A的规定。 5 检验步骤 用过滤海水清洗病鱼溃烂组织，收集清洗液，离心（2000r/min，5min），用过滤海水反复洗涤沉 淀物。将洗涤后的沉淀物放入用磷酸盐缓冲液 （0.1mol/L， pH7.2） 配制的1%戊二醛中固定20min30min， 固定时应不时摇动，使材料均匀分布在固定液中。低速离心 （1500r/min）去掉上清液，用缓冲液洗涤 沉淀物数次。在30%、50%、70%、80%、90%、 100%梯度乙醇脱水处理各5min，各级离心均为1000r/min， DB37/T 420.2-2004 2 收集虫体，将含有无水乙醇的虫体滴于载玻片上，临界点干燥仪干燥、离子溅射仪喷金后

5、于扫描电镜下 观察。 6 结果判定 指状拟舟虫体动基列约为20列22列，口区开阔，长可超过体长的一半，口区内3片小膜，位于虫 体近顶端小膜1(M 1)呈短小的短三角形，约由10多个毛基粒组成，小膜2(M 2)长约14m 16m，为相互 平行的3排纵行的毛基粒列，含有几个毛基粒。口侧膜（PM）起始于M 2中部，自M 2中部至M 3前端为一单列 毛基粒，后变为“之”形的双动基列构造，并绕行至胞口（Cs）后。盾片（Sc）呈倒三角形，由多对毛 基粒组成。虫体尾端为多个毛基粒构成的尾毛多复合体（CCo），单一尾毛由此发出，大核（Ma）、小 核（Mi）各一个，位于虫体中部。大核为不规则椭圆形，小核近球形，位于大核上方。 图1 指状拟舟虫纤毛及核器模式图（左 腹面观，右 背面观） DB37/T 420.2-2004 3 附 录 A （规范性附录） 试剂配方 A.1 磷酸盐缓冲液 甲液： Na2HPO42H2O 35.61g 用蒸馏水定容至1000ml。 乙液： NaH2PO42H2O 27.60g 用蒸馏水定容至1000ml。 分别量取甲液和乙液36.0ml、14.0ml，混合后即为0.2M磷酸盐缓冲液 A.2 1%磷酸缓冲戊二醛固定液 0.2M磷酸盐缓冲液 50ml 25%戊二醛水溶液 4ml 上述两溶液混合后，用双蒸水补充至100ml。