高通量测序技术平台流程及应用.ppt

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1、高通量测序技术平台流程及应用,主要内容,高通量测序平台简介 三大NGS平台测序流程 主要步骤 三大NGS平台其他应用方向 NGS其他应用方向测序流程举例 以Illumina平台为例,SOLiD全称为supported oligo ligation detetion，它的独特在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。,2005年底，454公司推出了革命性的基于基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，其特点是边合成边测序（sequencing-by-synthesis）。之后454公司被Roche以1.55亿美

2、元收购。一年后推出新一代GS FLX。,Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术”DNA簇”和”可逆性末端终结(reversible terminator)”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Solexa于2007年被Illumina以6亿美金收购,三大NGS平台测序流程,片段化DNA回收PCR扩增文库有效性验证,主要步骤,三大NGS平台其他应用方向,ABI SOLiD系统应用方向,测序和重测序 全基因组表达图谱分析 SNP分析 microRNA分析 ChIP分析 DNA甲基化分析,Roche GS FLX系统应用方向,微生物（基因组和

3、抗药性） 艾滋病毒（抗药突变和预诊） 肿瘤基因组和突变 环境基因组（Metagenomics） 传染病源快速鉴定 DNA甲基化 多重单核苷酸多态性（SNP）分析 转录基因组研究 全基因组小分子RNA（miRNA）分析 细菌人工染色体 人体基因组结构和突变 染色质免疫沉淀 考古学,Illumina Genome Analyzer系统应用方向,DNA Fragment文库测序 DNA Mate-pair文库测序 Small RNA测序 数字化表达谱测序 转录组测序 DNA甲基化测序 ChIP-seq Meta-Genomics DNA测序 血浆微量DNA测序,NGS其他应用方向测序流程举例 -以I

4、llumina平台为例,基因组DNA的随机打断 DNA片段的末端修复 将A碱基加入到DNA片段的3末端 在DNA片段的末端加上特定接头 PCR扩增连上接头的DNA片段 文库检测 DNA在Cluster Station的成簇扩增 Illumina Genome Analyzer上的测序 生物信息组装/分析,Illumina DNA Fragment文库测序流程,Illumina Mate-pair文库测序流程,基因组DNA随机打断特定大小片段（2-10kb范围可选） 末端修复 生物素标记 环化 获得来自大片段两端共计400-600 bp的DNA片段 修饰、加接头 PCR扩增连上接头的DNA片段

5、文库检测 DNA在Cluster Station上的成簇扩增 Illumina Genome Analyzer上的测序 生物信息组装/分析,Illumina Small RNA测序流程,从总 RNA中分离 small RNA 5接头连接和纯化 3接头连接纯化 RT-PCR扩增 Small RNA文库的纯化 文库的检测 DNA在Cluster Station成簇扩增 Illumina Genome Analyzer上的测序 生物信息学分析,Illumina 数字化表达谱测序流程,mRNA的分离和cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 限制性内切酶NlaIII的酶切 连接GEX NlaIII

6、Adapter 1 限制性内切酶 MmeI 的酶切 连接GEX Adapter 2 Adapter连接cDNA产物和PCR富集 文库的检测 DNA在Cluster Station上的成簇扩增 Illumina Genome Analyzer上的测序 生物信息学分析,Total RNA的DNase I 酶消化 mRNA 分离和随机打断 cDNA第一链和第二链的合成 DNA片段的末端修复 将“A”碱基加入到DNA片段的3末端 在DNA片段的末端加上特定接头 PCR扩增连上接头的DNA片段 文库的检测 DNA在Cluster Station上的成簇扩增 Illumina Genome Analyze

7、r上的测序 生物信息学分析,Illumina 转录组测序流程,基因组DNA随机打断 DNA片段的末端修复 将 A 碱基加入到 DNA片段的3末端 DNA片段末端加上特别处理的甲基化接头 重亚硫酸盐处理 去盐处理 PCR扩增连上接头的DNA片段 文库检测 DNA 在Cluster Station上的成簇扩增 Illumina Genome Analyzer上的测序 生物信息学分析,Illumina DNA甲基化测序流程,染色质免疫共沉淀 目的DNA片段 DNA片段的末端修复 将 A 碱基加入到 DNA片段的3末端 DNA片段末端加上接头 PCR扩增加上接头的DNA片段 文库检测 DNA在Clus

8、ter Station成簇扩增 Illumina Genome Analyzer上的测序 生物信息学分析,Illumina ChIP-seq测序流程,Meta基因组的提取 DNA随机打断 DNA片段末端修复 将A碱基加入到DNA片段的3末端 在DNA片段的末端加上接头 纯化连接产物 PCR扩增连上接头的DNA片段 文库的检测 DNA在Cluster Station的成簇扩增 Illumina Genome Analyzer上的测序 生物信息组装/分析,Illumina Meta-Genomics DNA测序流程,收集10-15ml孕妇外周血 提取血浆中游离DNA Q-PCR定量总DNA含量 构建DNA文库 Agilent和Q-PCR检测文库浓度 Cluster制备和Genome Analyzer上的测序 Pipeline 和Eland分析 计算每条染色体的Z-score值,Illumina 血浆微量DNA测序流程,Have a Good Journey in the NGS ,