生物技术制药重点总结.pdf

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1、生 物 技 术 制 药 重 点 总 结 第一 章 绪论 生 物技 术的 概念 ， 基 因工 程 、 细 胞工 程 、 发 酵与 酶工 程 、 蛋 白质 及抗 体工 程及 生物 转化 的概 念 生 物 技 术 b io t ec hn ol o gy 又 称 生 物 工 程 bi o e ng i ne erin g ， 指 人 们 以 现 代生 命 科 学 为 基 础 ， 结合 先进 的工 程技 术手 段和 其他 基础 学科 的科 学原 理 ， 按照 预先 的设 计改 造生 物体 或加 工生 物原 料， 为人 类生 产出 所需 产品 或达 到某 种目 的的 技术 基 因 工 程 ge n et

2、 ic en g i ne er in g 也 称 遗 传 工 程 ， 是 现 在 生 物 技 术 的 核 心 和 主 导 。 主 要 原 理是 应用 人工 方法 将生 物的 遗传 物 质 ， 通 常是 DN A 分 离出 来 ， 在 体外 进行 切割 、 拼 接和 重 组 ， 然 后将 重组 了的 DN A 导 入某 种宿 主细 胞或 个体 ， 从 而改 变它 们的 遗传 品性 ； 有 时还 使新 的 遗传 信息 在新 的宿 主细 胞或 个体 中大 量表 达 ， 以 获得 基因 产物 （ 多 肽或 蛋白 质 ） 。 （DN A 重 组技 术， 分子 杂交 技术 ，基 因操 作） 细 胞 工

3、程 ce l l e ng i ne er in g 指 以细 胞 为 基本 单 位 ， 在 体外 条 件 下进 行 培养 、 繁 殖 ， 或 人 为 地 使 细 胞 某 些 生 物 学 特 性 按 人 们 的 意 愿 发 生 改 变 ， 从 而 达 到 改 良 生 物 品 种 和 创 造 新 品 种， 加速 繁育 动植 物个 体， 或获 得某 种有 用的 物质 的过 程 发 酵 工 程 f er m en ta ti o n e ng i ne er in g 是 通 过 现代 技 术 手 段 ， 利 用 微 生物 的 特 殊 功 能生 产有 用的 物质 ，或 直接 将微 生物 应用 于工

4、业生 产的 一种 技术 体系 酶 工 程 e nz y me e ng i ne er in g 是 利 用酶 或 细 胞所 具 有 的特 异 催化 功能 ， 或 对 酶进 行 修 饰 改造 ，并 借助 生物 反应 器和 工艺 过程 来生 产人 类所 需产 品的 一项 技术 抗 体 工 程 an t i bo dy e ng i ne er in g 是 利 用细 胞 生 物学 或 分 子生 物 学手 段在 体 外 进行 遗 传 学 操作 ， 改 变抗 体的 遗传 特性 和生 物学 特性 ， 以 获得 具有 适合 人们 需要 的 、 有 特定 生物 学特 性和 功能 的新 抗体 ，或 建立 能

5、稳 定获 得高 质量 和产 量抗 体的 技术 生 物 转 化 bi o tr an sf o rm at io n 也 称 生 物 催 化 b io ca ta ly si s 是 利 用 酶 或 有 机体 （ 细 胞 、 细胞 器 ） 作为 催化 剂实 现化 学转 化的 过程 ， 是生 物体 系的 酶制 剂对 外源 性底 物进 行结 构性 修 饰所 发生 的化 学反 应 生 物 技 术药 物 bi o te ch no l og ic al d ru g 是 指 采 用 DN A 重 组 技 术 或 其 他 生 物 技 术 生 产 的 用于 预防 、治 疗和 诊断 疾病 的药 物， 主要 是

6、重 组蛋 白或 核酸 类药 物 生 物 技 术药 物 的 特 性 ： （ 1 ）理 化性 质特 性： 相对 分子 质量 大， 结构 复杂 ，稳 定性 差。（ 2 ） 药 理学 作用 特性 ： 活 性与 作用 机制 明确 ， 作 用针 对性 强 ， 毒 性低 ， 体 内半 衰期 短 ， 有种 属特 异性 ，可 产生 免疫 原性 （ 3 ） 生 产制 备特 性 ： 药 物分 子在 原料 中含 量低 ， 原 料液 中常 存在 降解 目标 产物 的杂 质 ， 制备 工艺 条件 温和 ，分 离纯 化困 难， 产品 易受 有害 物质 污染 （ 4 ） 质 量控 制特 性 ： a 质 量控 制内 容的 特殊

7、 性 （ 质 量标 准 ： 基 本要 求 、 制 造 、 检 定等 ； 化 学药 物的 质量 标准 ： 性 状 、 鉴 别 、 检 查 、 含 量测 定等 ） ， b 制 造项 下的 特殊 规定 ， c 检 定项 下的 特殊 规定 生 物 技 术 制 药 b io te ch no lo g ic al ph a r ma ce ut ic s 是 指 利 用 基 因 工 程、 酶 工 程 、 发 酵 工 程 、 细 胞工 程 、 蛋 白质 工程 等生 物技 术 ， 来 研究 、 开 发和 生产 用于 预防 、 治 疗和 诊断 疾 病的 药物 第二 章 基因 工程 制药 外 源 基 因在 原

8、核 生 物中 表达 的 重 要 调控 元 件 A 启 动 子 pr omot or 是 DN A 链 上能 与 RN A 聚 合酶 结合 并起 始 mR N A 合 成的 一段 序列 ， 其 功 能是 起始 目标 基因 mR NA 的合 成， 是决 定外 源基 因在 原核 生物 中表 达效 率的 关键 因素 。 B 核 糖 体 结 合 位 点 ： SD 序 列 。 C 终 止 子 ： 终 止子 序 列 te r m in a to r se quen ce 是 基因 3 - 末端 能被 RN A 聚合 酶识 别并 停止 转录 功能 的特 定 DN A 序列 。 外 源基 因在 大肠 杆菌 中的

9、 表达 方式 ： a 胞 内表 达 ： 非 融合 蛋白 的胞 内表 达和 融合 蛋白 的 胞内 表达 ， b 分泌 表达 ：分 泌至 周质 和分 泌至 胞外 。 大肠 杆菌 中外 源基 因表 达效 率的 影响 因素 A 外 源 基 因密 码 子 ， B 、 m RN A 结 构 ， C 表 达 载 体， D 、 外 源 蛋白 稳 定性 酵母 表达 系统 的优 点： 高表 达量 ，高 稳定 性， 翻译 后修 饰功 能， 分泌 表达 。 外源 蛋白 在酵 母表 达系 统中 的影 响因 素 a 外源 基因 结构 ， b 表达 形式 及信 号肽 的选 择， c 启动 子， d 转化 子的 拷贝 数，

10、e 甲醇 诱导 浓度 、时 间、 温度 ， f 外源 蛋白 的降 解。 基因 工程 药物 的质 量控 制与 小分 子药 物质 量控 制相 比， 不同 的方 面 A 鉴别 方法 不同 ：基 因工 程药 物的 Mr 远大 于小 分子 化学 药物 。 B 鉴定 方法 不同 ：基 因工 程药 物结 构复 杂（ 空间 结构 ） ，需 要多 种检 测方 法。 C 杂 质来 源不 同 ： 基 因工 程药 物杂 质来 源于 宿主 蛋白 残留 和宿 主基 因残 留 。 小 分子 药物 杂志 来源 于合 成过 程中 原料 残留 、合 成副 产物 和纯 化中 溶剂 残留 。 D 药物 定量 方面 ，基 因工 程药

11、物定 量方 法一 般采 用生 化反 应的 方式 。基 因工 程药 物质 量控 制的 项 目 ： a 蛋 白含 量测 定 、 b 蛋 白纯 度分 析 、 c 蛋 白性 质测 定 、 d 生物 学效 价测 定、 e 杂质 分析 等。 (1 ) 蛋白 质含 量测 定方 法： a. 紫 外 吸 收 法 ： 28 0nm 处 吸收 峰 ， 优 点 ： 快 速 、 对 蛋白 质无 破坏 性 。 缺 点 ： 不 是严 格定 量， 核酸 可引 起强 干扰 。 b . BC A 法 ：二 辛可 宁酸 bi c in chon inic ac i d , 在 56 2 n m 处有 最大 吸收 。 c . Lo

12、wr y 法 ：福 林 - 酚试 剂， 灵敏 ，准 确度 高， 操作 步骤 多， 影响 因素 多。 d. 考 马 斯 亮兰 法 ： 59 5nm 处有 最大 吸收 。灵 敏， 操作 简单 ，抗 干扰 能力 弱。 e. SD S- P AG E 扫 描 分 析法 。 (2 ) 蛋 白质 纯度 检测 的方 法 ： a 电 泳法 ， b 质 谱法 ， c 层 析法 ， d 末 端氨 基酸 残基 分析 法 。 SD S - 聚丙 烯酰 胺凝 胶法 （电 泳法 ）是 目前 最常 用的 鉴定 蛋白 质纯 度的 方法 。 第三 章 动物 细胞 工程制药 动 物 细 胞 工 程 a ni m al ce l

13、l e ng i ne er in g 是 指 根 据 细 胞 生 物 学 及 工 程 学原 理 ， 定 向 改 变动 物细 胞内 的遗 传物 质从 而获 得新 型生 物或 特种 细胞 产品 的一 门学 科。 体外 培养 动物 细胞 的类 型： 贴壁 依赖 性细 胞、 非贴 壁依 赖性 细胞 、兼 性贴 壁细 胞。 动 物细 胞培 养的 条 件 ： 培 养温 度 25 - 2 8 度 。 PH 值 7. 2-7. 4 ， 低 于 6. 8 或 高于 7. 6 对 细胞 生 长 不 利 。 通 氧 量 ： CO 2 培 养 箱 。 防 止 污 染 ： 显 著 污 染 的 标 志 PH 值 迅 速

14、 改 变 、 细 胞 外 形 模 糊、 出现 漂浮 的细 胞集 落， 加入 抗生 素。 基本 营养 物质 。渗 透压 。 动 物 细 胞 培 养 特性 ： （ 1 ） 细 胞比 微生 物 细胞 和植 物 细胞 大 ， 抗 机械 强度 低 ， 对 剪切 力敏 感 ， 适 应环 境能 力差 ， （ 2 ） 倍 增时 间长 ， 生 长缓 慢 ， （ 3 ） 对 培养 基要 求高 ， 易 受污 染 ， 加 入 抗生 素 。 （ 4 ）贴 壁生 长， 有接 触抑 制现 象 。 （ 5 ）产 物分 泌于 细胞 外。 培养 方式 ：细 胞的 原代 培养 、传 代培 养、 细胞 克隆 培养 原代 培养 ：组

15、织块 培养 法和 单层 细胞 培养 法 组 织 块 培养 法 t is su e cu l t ur e 是将 动物 组织 切成 直径 1 2mm3 小块 进行 培养 的方 法。 单 层 细 胞 培 养 法 m on ol ay er c el l c ul t ur e 是 将 动物 组 织 块中 粘连 在 一 起 的 细胞 用 酶 法 或 物理 分散 法分 散成 单个 细胞 ， 制 成细 胞悬 液 ， 经 计数 、 稀 释后 ， 接 种于 无菌 培养 液中 ， 37 C 、 5% C O2 空气 下进 行原 代培 养， 细胞 即开 始生 长并 逐渐 形成 单层 。 细 胞 克 隆 培 养

16、法 c lo n al cu l t ur e 即 单细 胞 分 离培 养 ，是 将 动 物组 织分 散后 ， 将一 个 细 胞 从群 体细 胞中 分离 出来 ， 由 单个 细胞 培养 成纯 系细 胞集 群 。 饲 养细 胞 ： 小 鼠胸 腺细 胞 、 腹腔细 胞。 动 物细 胞 培养 常用 的 其他 溶 液： 平 衡盐 溶液 、 培养 基 PH 调 整液 、 细胞 消化 液 （胰 蛋 白 酶溶 液、 ED T A 液 ） 、抗 生素 溶液 （青 霉素 、链 霉素 、卡 那霉 素、 制霉 菌素 ） 。 动 物细 胞的 大规 模培 养方 法： A 悬 浮培 养法 Ma i t la nd s c

17、u l t u re ， B 微 载体 培养 法， C 多 孔 载 体培 养 法 ， D 微 囊 化 培养 法 ， E 中 空 纤 维 培 养 法 ho l l ow f il e r c el l c ul t ur e 是 模 拟 细胞 在体 内生 长的 三围 状态 ， 把细 胞接 种在 中空 纤维 的外 腔 ， 利用 中空 纤维 模拟 人工 毛细 血 管供 给营 养可 以使 细胞 高密 度的 生长 。 动 物 细 胞 生 物 反 应 器 的 类 型 ： a 搅 拌 式 生 物 反 应 器 、 b 气 升 式 生 物 反 应 器 、 c 中 控 纤 维 式 生 物 反 应 器 、 d 透

18、析 袋 式 或 膜 式 生 物 反 应器 、 e 固 定 床 或 流 化 床 式 生 物 反应 器 、 f 一 次 性 摇袋 式细 胞培 养生 物反 应器 。 动 物细 胞生 物反 应器 的主 要操 作模 式 ： a 分 批式 操作 、 b 补 料 - 分 批操 作 、 c 半 连续 式操 作、 d 灌流 式操 作、 e 连续 式操 作。 转 基 因 动 物 制 作 方 法 ： a 基 因 显 微 注 射 法 、 b 反 转 录 病 毒 感 染 法 、 c 胚 胎 干 细 胞 法 、 d 精子 载体 导入 法、 e 基因 打靶 法、 f 酵母 人工 染色 体法 。 转 基因 动物 tr a n

19、 sg e ni c an imal ： 采 用基 因工 程技 术把 外源 目的 基因 导入 动物 生殖 细胞 、 胚胎 干细 胞和 早期 胚胎 ， 并在 受体 动物 的染 色体 上稳 定整 合 ， 再经 过发 育途 径把 外源 目的 基 因稳 定地 传给 子代 ，通 过这 项技 术所 获得 的动 物即 使转 基因 动物 。 细 胞 核 移 植 技 术 n uc l ea r t ra n sp la nt a ti on 是 指 一 个 动 物 的 细 胞 核 移植 至 去 核 的 卵 细 胞中 ，产 生与 供细 胞核 动物 的遗 传成 分一 样的 动物 的技 术。 第四 章 抗体 工程 制

20、药 抗 体 工 程 制 药 a nt i bo dy en g i ne er in g p ha rm ac eu ti c s 是 指 利 用 基 因 工 程、 细 胞 工 程 和 转基 因动 物及 转基 因植 物技 术生 产抗 体药 物的 过程 。 单 克隆 抗体 mo n o cl o na l an t i bo d y, mA b 简 称单 抗， 是由 一个 B 细 胞和 一个 骨髓 瘤细 胞 融合 而成 的杂 交瘤 细胞 合成 及分 泌的 抗单 一抗 原表 位的 特异 性抗 体。 单克 隆抗 体 及其 制备 原理 （主 要是 理解 ） 抗 体的 结 构： 4 条 多肽 链 （ 2

21、 条 相同 的 重链 和 2 条 相同 的 轻链 ） 通过 二硫 键 连接 而成 ， 为 “ Y ” 字形 结构 。 杂交 瘤细 胞的 筛选 ： HA T 选择 性培 养基 。 噬 菌体 抗菌 库技 术 的筛 选方 法 ： （ 1 ） 固 相或 液相 纯 化 抗 原 的 筛 选 ： a 将 纯化 抗原 包被 在固 相介 质上 （ 酶标 板 、免 疫试 管 、亲 和层 析 柱 ） ， 然后 加入 待 筛选 的 噬菌 体， 洗 去非 亲和 性 或 低亲 和性 的噬 菌体 ， 回 收高 亲和 性的 噬菌 体 。 b 将 抗原 与生 物素 集团 相连 ， 再 将其 结合 在 包被 有链 亲和 素的 磁

22、珠 上对 噬菌 体进 行筛 选 。 （ 2 ）全 细胞 筛选 ， （ 3 ）用 切片 组织 进行 筛选 第五 章 疫苗 及其 制备技术 疫 苗 va ccin e 是 由病 原微 生物 本身 制备 而成 的抗 病制 剂 ， 广 义的 疫苗 包括 细菌 、 病 毒和 立 克 次 体 等 病 原 微 生 物 制 成 的 疫 苗 ， 注 射 或 黏 膜 途 径 接 种 后 使 机 体 产 生 抗 体 或 致 敏 淋 巴 细 胞， 达到 特异 性免 疫的 效果 ，使 机体 获得 保护 或消 灭该 致病 原。 毒 株 须 具备 的 条 件 ： （ 1 ）持 有特 定的 抗原 性； （ 2 ）有 典型 的

23、形 态和 感染 特定 组织 的特 性， 并能 保持 其生 物学 特性 ； （ 3 ）易 在特 定组 织中 大量 繁殖 ； （ 4 ）不 产生 神经 毒素 或能 引起 机体 损害 的其 它毒 素； （ 5 ）如 制备 活疫 苗， 繁殖 过程 中无 恢复 原致 病性 的现 象； （ 6 ）未 被其 它病 毒污 染。 强毒 种的 选育 ： （ 1 、强 毒种 来源 ：典 型传 染病 分离 培养 ; 保藏 中心 提供 。 （ 2 、强 毒种 分离 ： A 、纯 粹试 验（ 分离 培养 、鉴 定 ） 。 B 、致 病力 （动 物、 鸡胚 、细 胞试 验 ） 。 C 、抗 原性 （免 疫及 反应 抗原 试

24、验 ） 。 D 、稳 定性 （传 代不 变异 ） 。 达到 ：毒 力强 ，纯 粹， 抗原 好， 稳定 的菌 种， 最后 冻干 保藏 。这 就是 强毒 菌种 的标 准 。 （ 3. 复壮 ：弱 毒菌 种在 敏感 动物 或细 胞上 多次 传代 ，达 到毒 力增 强的 目的 弱毒 种的 选育 ： （ 1 、来 源： 自然 界筛 选和 人工 诱变 。 （ 2 、弱 毒筛 选途 径： 初选 的依 据： 生物 性状 改变 。 活 疫苗 （ li v e va c c in e ） ： 选用 无 毒或 弱毒 但 免疫 原 性高 的 菌种 ，经 培 养、 繁 殖后 制成 的。 死 疫苗 （ ki l l ed

25、 va ccin e ） ： 包 括灭 活疫 苗 （ 由 完整 的病 毒或 细菌 经灭 活剂 灭活 后制 成 ， 即 要使 病原 体 充分 死 亡， 丧失 感 染性 或毒 性 和致 病 性， 又要 保留 其免 疫原 性） 和 亚 单位 疫苗 （ 将病 原体 经物 理或 化学 方法 处理 ， 除去 无效 物质 ， 提取 其有 效抗 原部 分制 备的 一类 疫苗 ） 活疫 苗与 死疫 苗的 特点 活疫 苗特 点： 可在 体内 繁殖 系统 免疫 反应 和局 部免 疫反 应 免疫 力持 久， 产量 高， 成本 低 有毒 力增 强和 反祖 危险 抗原 干扰 现象 保存 条件 苛刻 多数 只需 免疫 一次

26、 ，接 种剂 量小 。 死疫 苗特 点： 不能 在体 内繁 殖， 性质 稳定 ，安 全性 高 有利 于制 备多 价或 多联 疫苗 比 较 安 全 ， 不 发 生 全 身 性 副 反 应 ， 无 毒 力 反祖 现象 受外 界影 响小 ，有 利于 保存 运输 免疫 剂量 大， 需多 次免 疫， 成本 高 只能 诱导 机体 产生 体液 免疫 通 常 需 要 用 佐 剂 或 携 带 系 统 来 增 强 其 免 疫 效果 疫 苗的 质量 检 测 ： （ 1 外观 检查 ： （ 2 pH 值 检测 ： （ 3 纯度 ： （ 4 宿主 细胞 DN A 和 蛋 白残 留量 检 测 ： （ 5. 无 菌检 查

27、： （ 6 热原 或细 菌 内毒 素检 查 ： （ 7 抗生 素检 测 ： （ 8 灭活 效 果的 验证 ： （ 9 异 常毒 性检 查 ： （ 10 稳 定性 试验 ： （ 11 效 力试 验 （ 生 物效 价 ） ： （ 12 佐 剂的 质量 评价 ： （ 13 疫 苗标 准品 或参 考品 的研 究： 多 糖的 纯化 方法 ： A 乙 醇沉 淀法 （ 最 常用 ） ， B 分 级沉 淀法 （ 用 不同 浓度 的有 机溶 剂分 级 沉淀 分子 大小 不同 的粘 多糖 ） ， C 季铵 盐络 合法 ， D 离子 交换 层析 法， E 凝胶 过滤 法 粘多 糖的 生物 学特 性： 粘多 糖是 指

28、含 有氨 基糖 和糖 醛酸 或它 的衍 生物 的多 糖。 第六 章 酶工 程制 药 酶的 催化 的显 著特 点： A 催化 效率 高， B 具有 专一 性， C 催化 作用 在体 内受 到调 节控 制 ( 区别 于一 般催 化剂 的重 要特 征 ) ， D 不稳 定性 。 酶分 离纯 化的 一般 程序 及 酶原 料选 择的 依据 一般 程序 ： （ 1, 、原 材料 的选 择和 预处 理： 选择 含目 的酶 丰富 的原 料， （ 2 、酶 的分 离 ， （ 3 、酶 的精 制 ， （ 4 、酶 的浓 缩干 燥及 结晶 。 传统 的酶 固定 化方 法： （ 1 、载 体结 合法 ：物 理吸 附法

29、 、离 子结 合法 、共 价结 合法 ，（ 2 、 交 联 法 c ro s s- li nk i ng me t ho d ： 是 利 用双 功 能 或多 功能 交 联试 剂 ， 在 酶 分子 和 交 联 试 剂 之 间 形 成 共 价 键 的 酶 的 固 定 化 方 法 ， 常 用 交 联 剂 戊 二 醛 、 己 二 胺 等 。 （ 3 、 包 埋 法 en t ra pmen t me thod : 是 载体 与 酶溶 液 混合 后， 借 助引 发剂 进行 聚合 反 应， 通过 物 理作 用 将 酶固 定在 载体 的网 格中 ，从 而实 现酶 固定 化的 方法 。有 网格 型和 微囊 型

30、。 常用 载体 有明 胶 、 聚酰 胺、 琼脂 等。 固 定化 酶 im mobi lize d en z y me 或 固定 化细 胞 im mobi lize d ce l l 是 将具 有一 定生 理功 能 的酶 或生 物细 胞 ， 用物 理或 化学 方法 将其 固定 ， 作为 固体 生物 催化 剂而 加以 利用 的一 种技 术 。 固定 化酶 的性 质和 指标 以及 其优 缺点 ： （ 1 、固 定化 后活 力的 改变 （增 强 ） ， （ 2 、 固 定化 对酶 稳定 性的 影响 ： 热 稳定 性提 高 ， 对 有机 试剂 及酶 抑制 剂的 稳定 性提 高 ， 对 PH 、蛋 白酶

31、、贮 存和 操作 条件 的稳 定性 提高 ， （ 3 、固 定化 酶的 最适 温度 变化 ：提 高， （ 4 、 固定 化 酶的 最 适 PH 值 变化 ： 用带 负 电荷 载 体， 最适 PH 向 碱性 偏 移； 用 带正 电 荷 载体 最适 PH 向酸 性偏 移。 （ 5 、 固定 化 酶的 米 氏常 数 Km 变 化： 中 性载 体 ， Km 上 升； 底 物与 载 体电 荷 相同 ， Km 增 加 ； 底 物 与 载 体 电 荷 相 反 ， Km 减 小 ； 高 级 结 构 变 化 及 载体 影 响引 起 酶 与 底 物 亲 和 力 变 化 ， 从而 Km 变化 ， Km 还受 离子

32、强度 的影 响， I 升高 ， Km 变化 逐渐 缩小 甚至 消失 。 （ 6 、固 定化 酶的 指标 ： A 固定 化酶 的活 力， B 偶联 率及 相对 活力 的测 定， C 固定 化酶 的半 衰期 ， D 固定 化酶 的热 稳定 性 酶反 应器 的基 本类 型： a 搅拌 罐式 反应 器， b 鼓泡 式反 应器 ， c 膜反 应器 ， d 喷射 式反 应器 ， e 填充 床式 反应 器， f 流化 床式 反应 器 35 酶 传感 器的 主要 类型 ： A 酶电 极， B 热敏 电阻 酶传 感器 ， C 离子 敏场 效应 晶体 管酶 传感 器， D 光纤 酶传 感器 酶反 应器 的性 能评

33、 价： A 固 定化 酶的 形状 ， B 底 物的 物理 性质 ， C 固 定化 酶稳 定性 ， D 酶 反应 动力 学特 性 。 参 数 ： 空时 、空 数、 转化 率、 生产 强度 。 酶反 应器 应用 的注 意事 项 ： 保持 酶反 应器 的操 作稳 定性 ， 保持 酶反 应器 中流 体的 流动 方 式和 状态 ，防 止酶 的变 性， 防止 微生 物的 污染 。 酶分 子的 定向 进化 ： 定向 进化 di rect ed ev o l u ti o n 和杂 合进 化 hy b r i d ev olut ion 是非 理性 化设 计。酶 分 子 的 体 外 定 向 进 化 d ir

34、ec te d mo l e cu la r ev o l ut io n in v it r o o f e nz ym e 是 指 不 需要 了解 酶的 空间 结构 和催 化机 制， 而是 人为 地创 造特 殊的 进化 条件 ，模 拟自 然进 化机 制 ， 在 体外 对酶 基因 进行 改造 ， 并 定向 筛选 、 获 得具 有某 些预 期特 征的 进化 酶 。 酶 分子 体外 定向 进化 的策 略： 随机 突变 、同 源改 组、 非同 源改 组、 结构 域改 组。 突变 酶的 概念 ： 突 变 酶 m ut a ti on al e nz ym e 是 指 采 用 基 因 工 程 技 术

35、对 天 然 酶 基 因 进 行 剪 切、 修 饰或 突 变， 通过 表达 修改 的基 因获 得的 在酶 学性 质上 符合 需要 的酶 。 抗 体 酶 ab z ym e 又称 催化 抗体 ，是 一类 免疫 系统 产生 的、 具有 催化 活性 的抗 体。 酶 的 化 学 修 饰 c he m ic al m od i fi ca ti o n of e nz y me 利 用 化 学 手 段 将 某 些 化 学 物 质 或 集 团 结合 到酶 分子 上 ， 或 将酶 分子 的某 部分 删除 或置 换 ， 改 变酶 的理 化性 质和 生物 活性 ， 这 种 应用 化学 方法 对酶 分子 进行 改造

36、 的技 术称 为酶 的化 学修 饰。 方 法 ： a 交 联技 术 （ 戊 二醛 交联 剂 ） 、 b 定 点突 变和 化学 修饰 结合 技 术 、 c 用 小分 子化 合 物 的修 饰、 d 用 单功 能聚 合物 的修 饰（ PE G 常 用化 学修 饰剂 ，提 高稳 定性 、降 低免 疫原 性 ） 、 e 引入 辅助 因子 。 第七 章 发酵 工程 制药 发 酵 工 程 的 概 念 fe r m en ta ti on e ng in ee ri ng 又 称 微 生 物工 程 ， 是 将微 生 物学 、 生 物 化 学和 化学 工程 学的 基本 原理 有机 的结 合 ， 利用 微生 物的

37、 特定 形状 ， 通过 现代 工程 技术 在生 物 反应 器中 生产 工业 原料 和工 业产 品并 提供 服务 的一 种技 术体 系 。 生物 技术 的四 大支 柱 ： 发酵 工程 、基 因工 程、 细胞 工程 和酶 工程 。 发酵 的定 义： 发 酵 f er m en ta ti o n 泛 指利 用 微生 物 制造 或生 产 某些 产品 的过 程 。 即 发酵 是 用生 物 催化 剂 使培 养物 质转 化成 产品 的生 物 化学 反应 。 生 物催 化剂 bi o c at alys t 是 细菌 、 放 线菌 、 真 菌 或其 解体 产物 （如 酶） 和动 植物 细胞 等。 发酵 工程

38、 制药 的基 本过 程： 上游 工程 、发 酵生 产、 下游 工程 。 微 生物 发 酵生 产药 物 的分 类 ： （ 1 抗 生素 类 ， （ 2 氨 基酸 类 ， （ 3 核 苷酸 类 ， （ 4 维 生素 类 ， （ 5 甾体 类激 素 ， （ 6 多糖 类 ， （ 7 治疗 酶及 酶抑 制剂 。 优良 菌种 的选 育 理想 的工 业发 酵菌 种的 要求 ： a 遗 传性 状稳 定 ； b 生 长速 度快 ， 不 易污 染 ； c 目 标产 物产 量尽 可能 接近 理 论转 化率 ； d目 标产 物最 好分 泌到 胞外 ； e 尽 可能 减少 类似 物的 产量 ； f 其 所利 用生 长

39、的 培养 基成 分简 单 、 价格 低廉 。 菌 种选 育 ： 经 验育 种方 法有 自然 选育 、 诱 变育 种 、 杂 交育 种等 ； 定 向育 种方 法有 控制 杂 交育 种、 原生 质体 融合 、基 因重 组等 。 （ 1 自 然选 育 na t u r al sc r e e ni n g ： 微生 物 不经 人 工处 理 可以 发 生自 发 突变 ，利 用微 生 物 在一 定条 件下 产生 自发 突变 的原 理 ， 通 过分 离 、 筛 选排 除衰 退型 菌株 ， 从 中选 出维 持或 高 于原 有生 产水 平菌 株的 过程 。 （ 2 定 向 培 育 di r e c ti v

40、e br eedi ng 是 指 为 了 获 得 某 些 需 要 性 状 的 品 系 ， 在 一 定 的 环 境 条件 下长 期处 理某 一微 生物 群体 ， 同时 不断 移种 ， 从而 积累 和选 择合 适的 自发 突变 体的 育种 方法 。 （ 3 诱 变育 种 mu t a ti on br e e di ng 是 利用 物理 或化 学诱 变剂 处理 均匀 分散 的微 生 物细 胞 群 ， 促 使其 突变 率大 幅度 提高 ， 然 后采 用简 便 、 快 速和 高效 的筛 选方 法从 中挑 选出 少数 符合 育 种目 的的 突变 株 。 优 点 ： 方 法简 单 、 快 速和 收效 显著

41、 ， 是 目前 主要 的育 种方 法之 一 ， 在 生 产中 得到 广泛 的应 用。 （ 4 杂 交育 种 hy b r i di z at ion br eedi ng 指 利用 真 核微 生 物的 有 性 生殖 或 准性 生 殖， 或 原核 生物 的接 合 、 转化 和转 导等 过程 ， 促使 两个 具不 同遗 传性 状的 菌株 进行 遗传 物质 交换 和 基 因重 组 ， 以 获得 优良 性能 或新 的品 种的 生产 菌株 。 是 重要 的微 生物 育种 手段 ， 具 有强 的方 向性 或目 的性 。 （ 5 原 生质 体 融 合 pr otop last fu s i on 又 称细

42、胞 融 合 ce l l fu s i on ， 指通 过 人 工手 段 ， 使遗 传性 状不 同的 两个 细胞 的原 生质 体发 生融 合 ， 并产 生重 组子 的过 程 。 是工 业微 生物 育种 的 重要 手段 ， 可 使一 些未 发现 有转 化 、 转 导和 接合 现象 的原 核生 物之 间及 微生 物种 、 属 、 科 间甚 至更 远缘 的微 生物 细胞 间进 行融 合， 获得 新物 种。 菌 种保 藏： 选 典型 菌 种的 优良 纯 种， 最 好保 藏休 眠 体（ 分生 孢子 、芽 孢 ） ； 创造 条件 使 之成 休眠 状态 ；多 种不 同的 手段 保藏 同一 菌种 。 保藏 方

43、法 ： a. 斜 面低 温保 藏法 ： 4 度 冰箱 ， 1 6 个 月 ， 适 用各 类菌 种 ， 简 便 、 存 活率 高 ， 保 藏期 短 、 代传 次数 多、 易变 异和 污染 。 b. 石 蜡油 封 存法 ：低 温 4C / 室 温、 阻 氧、 灭菌 ， 1- 2 年 中期 保 藏， 适用 各 大类 菌 种， 不 适于 分解 烃类 菌种 。 c. 砂 土管 保藏 法 ： 4C / 室 温 ， 灭 菌干 燥真 空密 封 ， 隔 氧 、 无 营养 ， 1 1 0 年 ， 常 用的 长期保藏 法， 适于 产孢 子的 微生 物及 行成 芽孢 的细 菌， 不适 于对 干燥 敏感 的细 菌。 d

44、. 麸 皮保 藏法 ： 曲 法保 藏 ， 低 温干 燥 ， 1 年 以上 ， 适 于产 孢子 的霉 菌及 放线 菌 ， 工 厂采 用较 多。 e. 甘油 悬液 保藏 法： -2 0 度， 0. 5 1 年； -7 0 度， 10 年。 基因 工程 菌常 用保 藏法 。 f. 冷冻 真空 干燥 保藏 法： 冻干 法， 5 1 5 年， 适于 各类 微生 物， 目前 被广 泛采 用。 g. 液 氮超 低 温保 藏法 ： -1 96 度 ， 15 年 以上 ， 适用 于各 类 微生 物 ，是 目 前公 认 的最 有效 的长 期保 藏技 术之 一。 h. 宿主 保藏 法： 适于 专性 活细 胞寄 生微

45、 生物 （病 毒、 立克 次体 ） 。 46 发 酵设 备： 发酵 罐的 基本 类型 有搅 拌釜 反应 器、 鼓泡 式反 应器 、气 升式 反应 器。 发酵 辅助 设备 ：无 菌空 气系 统、 灭菌 系统 、发 酵车 间的 管道 及阀 门等 。 发酵 过程 中的 中间 分析 项目 ： （ 1 、产 物产 量： 通过 监测 产物 产量 判断 发酵 结果 ，化 学测 定法 。 （ 2 、 PH 值 ： 代 谢产 物影 响培 养液 pH 值 ， 通 过培 养基 中的 组分 维 持合 适的 pH 值 ， 或 通 过人 工方 法进 行调 节。 （ 3 、 糖： 糖的 消 耗反 应 菌体 代谢 活 力的

46、变化 。通 过糖 量测 定 ，间 接推 测 产物 生 物合 成 效率 。 （ 4 、 氨基 氮： 通 过测 定 游离 氨基 酸 的数 值， 侧面 反应 微生 物 含氮 物质 的 代谢 ， 推测 发 酵情 况。 （ 5 、菌 丝形 态： 通过 检测 菌丝 形态 ，监 测微 生物 生长 状态 ，及 时调 整发 酵策 略。 发酵 过程 的影 响因 素及 控制 ： （ 1 、 菌 体 浓 度 的 影响 及控 制 ：菌 体 浓度 是指 单 位体 积 培养 液中 的 菌体 含量 。菌 体浓 度 对 发酵 产物 的影 响 ： a 适 当生 长速 率下 ， 产 物的 产率 和菌 体浓 度成 正比 ;b 菌 体

47、浓 度过 高 ， 使 营 养 物 质 消 耗 过 快 ， 有 毒 物 质 积 累 ，溶 解 氧减 少 ， 抑 制 产 物 生 成 ;c 菌 体 浓 度 过 低 ， 产 物 生 成减 少。 菌 体浓 度的 控制 ： 通 过控 制培 养液 中营 养基 质的 浓度 。 基 础培 养基 各成 分要 有适 当配 比 。 通过 中间 补料 调整 培养 基成 分 ， 如当 菌体 浓度 太低 时 ， 可补 加一 部分 磷酸 盐和 碳源 促进 生长 。 （ 2 、 营 养 物 质 对发 酵的 影响 及控 制： a 碳 源 ： 速 效碳 源 ： 迅 速被 利用 ， 有 利于 菌体 生长 ， 如 葡萄 糖 、 枸

48、橼酸 。 迟 效碳 源 ： 缓 慢 被利 用 ， 有 利于 次生 代谢 产物 的合 成 ， 如 淀粉 多糖 、 乳 糖 、 油 脂 。 常 用含 有两 种碳 源的 培养 基进 行控 制 。 B 氮 源 ： 速 效氮 源 ： 迅 速被 利用 ， 有 利于 菌体 生长 ， 如 玉米 浆 ， 氨 基态 氮的 氨 基酸 。 迟 效氮 源 ： 缓 慢被 利用 ， 有 利于 次生 代谢 产物 的合 成 ， 如 黄豆 饼粉 。 用 含有 两种 氮 源 的培 养基 进行 控制 。 C 磷 酸盐 ： 对 初级 代谢 产物 ， 磷 酸盐 通过 促进 细菌 生长 对产 物生 成进 行 调节 。 对 次级 代谢 产物

49、 ， 常 采用 生长 亚适 量的 磷酸 盐 ， 提 高产 物生 成 。 D 补 料的 控制 ： 在 发 酵过 程中 ， 通 常补 加基 质和 前体 ， 促 进产 物合 成 。 作 用 ： 避 免菌 体过 度衰 老 ， 使 产物 合成 期延 长。 控制 pH 值和 代谢 方向 。补 足发 酵液 体积 ，改 善通 气。 （ 3 温 度 的影 响及 控制 ：发 酵热 = 生物 热 + 搅拌 热 - 蒸发 热 - 辐射 热 - 显热 影 响 ： a 影 响 酶 的 反 应 速 率 。 b 影 响 代 谢 调 控 机 制 。 c 通 过 改 变 发 酵 液 的 物 理 性 质 影 响 产 物合 成 。 温 度的 控制 ： A 在 发酵 不同 阶段 ， 采 用不 同温 度 : 初 期提 高温 度 ， 促 进菌 体生 长 ; 中 期 降 低 温 度 ， 促 进 产 物 合 成 ; 后 期 提 高 温 度 ， 节 省 发 酵 时 间。 B 针 对 不 同 条 件 ， 采用 不 同 温 度 ： 通 气差 ， 培 养基 稀薄 时 ， 降 低温 度 ； 通 气好 ， 培 养基 影响 丰富 时 ， 升 高温 度 ； 菌 体生 长快 时， 维持 较短 时间 高温 ；菌 体生 长慢 时， 维持 较长 时间 高温 。 （ 4 、 PH 值 的