GB T 19495.5-2004 转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法.pdf

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1、ICS 71. 100. 30 y 88 中华人民共和国国家标准GB/T 20617-2006 烟花爆竹烟火药中铁含量的测定Fireworks and firecrackers一Deter咽inationof ferrum content in pyrotechnic composition 2006心9-18布2007-02心1实施中华人民共和国国家质量监督检验检技总局堪舍中国国家挺准化管理委员会CJO 0. 4 1 10 0. I tec Mix(2 Y 2) dlJTP urncil i-glycosylase, 3）反应缓冲液（吉ROX),4) dJTP m.x. 正向引物和反向引物见

2、轰A.1探针见表.1注：ROXcacboxy-X chodmine a T叫ManUnivecsal Maste. Mox是由AB!公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了万便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具杳相同的效果，则可使用这些等效产品。A. 3. 1. 1. 4 反应参数检测转基因大豆C;TS-403 2中结构特异性基因的实时荧光PCR反应参数见表A.3。表A.3 实时荧光PCR反应参数a作用时间is温度1c去污染120 50 活化DiA合成酶和预变性600 95 PCRC45个循环变性15 95 延伸60 60 a ABl Pcism 7700/7900

3、SOS仪器的反应事数a给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的嗷果，则可使用这些等效产品。A. 3. 1. 1. 5 结果计算根据转基因大豆c;Ts40 3 2结构特异性基因的绝对含量，口I按式（A.ll计算其在测试样品中的相对含量A. 3. 1. 2方法2转基因产品的含量C%J测试样品中结构基因的拷贝数100-( A.1 测试样品中内源基因的拷R数A. 3. 1. 2. 1 检测基因卒方法检测转基因大豆G丁s40 :l 2结构特异性摹因川、：TP与CP4EPSPS边界序列和大豆内源Lcctin基因。A. 3. 1. 2. 2 定量检测低限本方法的

4、绝对定量检测低限为20个拷贝，相对定量检测l低限为0.1%,A. 3. 1. 2. 3 主要试剂A. 3. 1. 2. 3. 1 号物和探针检im转基网大豆c;Ts10 3 2结构特异性主主因及大豆内源Leetin基因所用51物序列和探针序列见表A.4o GB月19495.5-2004我A.4 检测转基因大豆GT百40-3-2结构特异性基因的引物序列和探针序列称包网萃序列l陀R反/(nmo/L) 正！每寻物5ccTl i GGA TT f CAG CJ T CAG T(足；.3I soo 结构卜士？亡i丁丁飞一一一一一一一一一一一一一二二反向寻物5 GAC TTG TCC C； GGA ATG

5、3 I 特异i二二斗二一一一一一一一一一一一一一一一! i探辛15 1 A C:(,C iAC CGC CCG CAA ATC CTAMRA3 I 200 一二二. I正削物5一（；川TC阳T:c，盯仄CA3 I 500 Lectin I反向引物I5一GCATCTG CAA GCC TTT T凹I 500 一.一旦iFAMA主豆豆：兰已ACTTC ACTAMRA3二L-=主注1,F八M,6 rn;boxyfluocescein, TAMRA, 6ca;loxytetrnmethykhodamme, 注2，结梅特异性塞在理扩增片段长度为121怜.1，四tin扩增片段长度为118b市A. 3. 1

6、. 2. 3. 2 反应体系实时荧光PCR反肢体系见表A.5。表A.5实对荧光PCR反应体系总反应体积加入量，25L DIA模扳（50吨成分2大豆Z葱困！l!D:-.IA加入虫草：2.5 L 成分2加入挺,12.5 L ) Tag-DNA Polymerase; TaqMan Univen泪iMaste; Mix(2 X ) 2) dUTP maci! Nglycosylase; 3）反应缓冲液（吉ROX;4) JNTP mix, 正向引物和反向引物见表A.4 捺针见表A.If主tROX口cacboxy-Xchodmme.a TaqMan Umversal Mae Mix是由AB!公司提供的产

7、品的商品名。绘出这一信息是为了方便丰标准的使用者并不代表对该产品的认巧。如果其他等效产品具有相娟的效果，翻可使用这楼等效产品。A. 3. 1. 2. 4 反应参数实时荧光PCR反）i参数见表A.5,表A.6实时荧光PCR反应参童!l:作用时间is120 温度f去污染活化PIA30 600 95 PCR(4Q卡德环）变I!延f申30 95 59 a AHi Prism 7700/7900 SIJS仪器的反成参数。给出这今信息是为了方便本标准的使用者并不代表对该产品的认民日。如果其他等效产品具有相同的放果，则uJ使用这些等妓产品。A. 3. 1. 2. 5 含量的计算根据转基因大豆GTS1032结

8、构特异性基因的绝对含量，可按式A.2）计算其在测试样品中的相GB/T 19495.5-2004 对含量：测试样品中结构基因的拷贝数转基因产品的含量（%） 100 ( A. 2) 测试样品中内源基因的拷贝数A. 3. 2 晶系特异性基因检测A. 3. 2. 1 检测基因本方法分别检测转基因大豆GTS40 3 2品系特异性基因（大豆基因组DNA与GTS40 3 2品系特异基因之间的边界序列）和大豆内源Lectin基因。A. 3. 2. 2 定量检测l低限本方法的绝对定量检测低限为40个100个拷贝。A. 3. 2. 3 主要试剂A. 3. 2. 3. 1 号物和探针检测转基因大豆GTS40 3 2

9、品系特异性及大豆内源Lectin基因的引物序列和探针序列见表A.7。表A.7 检测GTS-40-3-2品系特异性基因的引物序列和探针序列基肉名称序页。PCR反应体系终浓度/(nmol/L) 正向引物5 TAG CA 1 CI A CA I A f A GCTc3 750 品系反向引物I5 GAC CAG GCC Af CCC CTC A 3 750 特异探针 5 F/M AC/ AAA L寸ATTT仪记正IC GGAGAAGATAMRA 3 200 正向引物5 CCA GCT TCG CCC CTT CCT TC 3 300 Leet in 反向引物5 GAA GGC AAG CCC ATC

10、TGC AAG CC 3 300 探针5 FAM CT I CAC CIT CIA JGC CCC TGA CAC TAMRA 3 160 注J,FAM, 6-cacboxyfluoceeein, TAMRA, 6 cacloxytetrnmethyl chodamine, 注2结构特异性基因扩增片段长度为85坤，Leetin扩增片段长度为74忡。A. 3. 2. 3. 2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表A.8,表A.8实时荧光PCR反应体系总反应体积加入量，25L 成分：加入量，2.5 L INA模板）阳性标准物质DNA模板豆250ng; 2）测试样品DN最大量为200吨。成分：加入量：

11、12.5 L l) Taq口NAPolymernse; TaqMan Univecsal1aec Mix(2 ) 2) dUTP urncil N glycosylaoc; 3）反应缓冲液（吉ROX);的dNfP mix. 正向引物和反作j引物见表A.7 探针见表A.7i主：ROXcacl】oxyX rhodmine. a T叫ManUniver51 Master Mix是由Alli公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，即j可使用这些等效产品。GB/T 1945.5”2004 A. 3. 2. 4 反应参数实时荧光P

12、CR反应参数兑表A.9。表A.9实时荧光PCR反应参数幢作用时l司h温度去污染120 50 i.&tt Jl：；八合成酶和预变性600 94 二二一一PCR(45个循环）变性30 94 延伸60 AB! Priom 7700/7900 SDS仪器的反应参数，给出这一信息是为了方便本标准的使用者并不代表对该产品的认可u如果其他等效产品具有相I司的效果，则写使用这些等效产品。A.3.2.5 结果计算根据转慕因大豆GTS40 3-2品系特异基因的绝对含蜜，可按式（A.3）计算其在测试样品中的相对含量最：转基因产品的含量山且辄如如胡培俨100叫A.3)GB/T 19495.5-2004 附录B（规范性

13、附录）转基因玉米MON810实时荧光PCR检测方法B. 1 范围本附录规定了转基因玉米MON810实时荧光PCR定量检测方法。本附录适用于食品、饲料、种子及其环境材料中转基因玉米MON810成分的实时荧光PCR定量检测。本附录也适用于转基因产品中转基因玉米MON810成分定性PCR检测阳性结果的确证检测。B. 2 原理采用实时荧光PCR技术和可特异性扩增转基因玉米MON810结构基因或品系特异性基因以及玉米内源基因的号物和两端标记荧光的探针，分别扩增测试佯品DNA，并实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增己知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子），以获得稳定的标准曲线。根据外

14、源基因（结构特异性基因或品系特异性基因）和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度），并由绝对含量计算转基因玉米MON810在测试样品中的相对含量。如采用限性标准分子时汁算相对含量应使用转换系数。B. 3 检测B. 3. 1 结构特异性基因检测B. 3. 1. 1 检测基因本方法检扭转基因玉米MON810结构特异性基因hsp70int与cry!A( b）的边界序列和玉米内源zSSIIb基因。B. 3. 1. 2 定量检测低限本方法的绝对定量检测低限为20个拷贝，相对定量检测低限为0.5%。B. 3. 1. 3 主要试剂B. 3. 1. 3. 1 号物和探针检测转基因

15、玉米MON810结构特异性基因及玉米内源zSSIIb基因的引物序列和探针序列见表B.1。表B.1 检测转基因玉米MON810结构特异性基因的引物序列和探针序列基因4号称序列PCR反而1体系终浓度/(nmnL) 正向引物5 GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG A 3 500 结构特异l反向引物5-GGA TGC ACT CGT TGA TGT TT；一3500 i探针了FAMAoxytetrnmet hylrhodam;ne, 注2结构特异性基因扩增片段长度为l13 bp.zSSllb扩增片段长度为151bp, 10 GB/T 19495.5-2004 B. 3. 1. 3.

16、 2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表B.Zo 表B.2 实时荧光PCR反应体系也反应体积加入量。25/L DJA模板（50ng) 成分玉米基因组DIA加入量，2.5 L 成分z加入量。12.5 L I) Taq DIA咀Polymerneein, TAMRA, 6 cacboxytetrnmethylchodaminc, 注2品系特异基因扩增片段长度为92bp.HMG扩增片段长度为79bp, B. 3. 2. 3. 2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表B.5。表B.5 实时荧光PCR反应体系总反应体积加人量，25L D刊A模板成分玉来基因组DIA加人量，5/L 成分：加人量,12.5 L

17、 1) T aq DNA Polymerne, TaqMan Univecoal Maotet Mix(2 Y 2) dUTP urncil N-glycooylaoe; 3）反应缓冲液（吉ROX),4J dNTP mix, 正向引物和反向引物见表B.4 探针见表B.4 注：ROXcacboxy-X chodmine a TaqMan Univetsal Mastet Mix是由AB!公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。B. 3. 2. 4 反应参数实时荧光PCR反应参数见表B.6。表B.6

18、 实时荧光PCR反应参数a作用时间Is温度去污染120 50 活化DIA合成酶和预变性600 95 PCRC45个循环）变性15 95 延伸60 60 a AB! Pcism 7700/7900 SDS仪器的反应参数。给出这一信息是为了方便本标准的使用者并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。B. 3. 2. 5 结果计算根据转基因玉米MON810品系特异性基因的绝对含量，可按式（忧2）计算其在测试样品中的相对含量2测试样品中品系特异性基因的拷贝数转基因产品的含量（%） 100 （日2) 测试样品中内源基因的拷贝数12 GB/T 19495.5-2004

19、附录C（规范性附录）转基因玉米Bt176实时荧光PCR检测方法C.1 范围本附录规定了转基因玉米Btl76实时荧光PCR定量检测方法。本附录适用于食品、饲料、种子及其环境材料中转基因玉米Btl76成分的实时荧光PCR定量检测。本附录也适用于转基因产品中转基因玉米Btl76成分定性PCR检测阳性结果的确证检测。C.2 原理采用实时荧光PCR技术和可特异性扩增转基因玉米Btl76结构特异性基因或品系特异性基因以及玉米内源基因的引物和两端标记荧光的探针，分别扩增测试样品DNA，并实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子），以获得稳定的标准曲线。

20、根据外源基因（结构特异性基因或品系特异性基因）和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度），并由绝对含量计算转基因玉米Btl76在测试样品中的相对含量。如采用阳性标准分子时计算相对含量应使用转换系数。C. 3 检测c. 3. 1 结构特异性基因检测c. 3. 1. 1 方法1c. 3. 1. 1. 1 检测基因本方法检测转基因玉米Btl76外源基因crylA(b）和玉米内源HMG基因。c. 3. 1. 1. 2 定量检测低限绝对定量检测低限约50个拷贝。相对定量检测低限为0.1%。c. 3. 1. 1. 3 主要试剂c. 3. 1. 1. 3. 1 引物和探针检测转

21、基因玉米Btl76结构特异性基因及玉米内源HMG基因的引物序列和探针序列见表C.l。表C.1检测转基因玉米Bt176结构特异性基因的引物序列和探针序列基因名称序歹1PCR反应体系终浓度/(nmol/L) 正向引物5 CCC ATC GAC ATC AGC CTG AGC 3 300 结构反向引物5CAGGA八GGCGTC CCA CTG GC 3 300 特异探针5 FAM A TG TCC ACC AGG CCC AGC ACG - T AMRA-3 160 正向引物5 TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3 300 HMG 反向引物5 GCT ACA fAG GG

22、A GCC flG TCC T-3 300 探针5 FAM CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA TAMRA 3 160 注l, FAM, 6 carboxyflumecei且，TAMRA,6-carboxytetramethylrhodamine。注2品系特异基因扩增片段长度为129忡，HMG扩增片段长度为79bp. 13 GB/T 19495.5-2004 c. 3. 1. 1. 3. 2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表c.2。表c.2 实时荧光PCR反应体系旦、反应体积加入量，25I. D:-.JA模板成分：玉米基因组D=IA加入量。5L 成分：加入量：12.

23、5 L I) Taq DNA Polymerase; 了。qManUnivernal Maste Mix(2) 2) dUTP uracil N glycosylase; 3）反应缓冲液（吉ROX);4) dNTP mix. 正向引物和反向引物见表已I探针见表C.l 注，ROX car boxy X rhodmine. a TaqMan Universal Master Mix是由ABI公司提供的产品的商品名。给出这信息是为了方便丰标准的使用者，并不代表对该产品的认可q如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。c. 3. 1. 1. 4 反应参数实时荧光PCR反应参数见表C.3.表

24、c.3 实时荧光PCR反应参数a作用时间s温度去污染120 50 活化DNA合成酶和预变性600 95 PCR(45个循环）变性15 95 延伸60 60 a ABI Prism 770017900 SDS仪器的反应参数。给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。c. 3. 1. 1. 5 结果计算根据转基因玉米Btl76结构特异性基因的绝对含量，可按式cc.1)计算其在测试样品中的相对含量：测试样品中结构基因的拷贝数转基因产品的含量（%） 100 ( C.1) 测试样品中内源基因的拷贝数c. 3. 1. 2 方法2c.

25、3. 1. 2. 1 检测基因本方法检测转基因玉米Bt176结构特异性基因crylA(b）与户epcintron的边界序列和玉米内源zSSIIb基因。c. 3. 1. 2. 2 定量检测低限绝对定量检测低限为20个拷贝。相对定量检测低限为0.1%。C. 3. 1. 2. 3 主要试剂c. 3. 1. 2. 3. 1 引物和探针检测转基因玉米Btl76结构特异性基因及玉米内源zSSIIb基因的引物序列和探针序列见表c.4, 14 GB/T 19495.5-2004 表C.4 检测转基因玉米Bt176结构特异性基因的引物序列和探针序列基冈! 名称序Jlj PCR反应体系终浓度/(nmol/U 正向

26、引物5 T(;T TC:J CCI GCJ GCJ ACC AG 3 500 结构反向引物5 ACT CCA仁TTTGT GCA GAA CJG /TC T 3 500 特异探针5 F AM ccc; A工，TG八CCG/CT八CCACA TCG A TAMRA 3 200 正向引物5 CTC CCI /TC CTT TGA CAT CTG C 3 500 zSSIIb 反向引物5 TCG A TT TCT CTC TTG GTG ACA GG 3 500 探针5 FAM AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-1AMRA-3 200 it 1 , FAM, 6 c

27、adoxyfluocescein, TAMRA, 6 ca cloxytetcamethylchodamine. 注2，结构特异性基因扩增片段长度为100忡，zSSIIb扩增片段长度为151忡。c. 3. 1. 2. 3. 2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表c.5. 表C.5实时荧光PCR反应体系总反应体积加入量，25L DNA模板（50ngl 成分z玉米基因组DNA加入量，2.5 L 成分，加入量,12.5 L ll丁aq-DNA-Polymecase;TaqMao Universal Master Mix(2 ) 2) dUTP uracil N-glycosylase; 3）反应缓冲

28、液（吉ROXl;4) dJTP mix. 正向引物和反向引物见表c.4 探针见在C4 注：ROXcarboxyX rhodminc 在TaqMan Universal Master Mix是由AB!公司提供的产品的商品名。给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。C. 3. 1. 2. 4 反应参数实时荧光PCR反应参数见表c.6. 表c.6 实时荧光PCR反应参数自作用时间、温度去污染120 50 活化DNA合成酶和预变性600 95 PCRt40个循环）变性:rn 95 延伸60 59 a AB! Prism 7700

29、17900 SDS仪器的反成参数2给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果真他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。15 GB/T 19495.5 2004 c. 3. 1. 2. 5 结果计算根据转基因玉米Btl76结构待异性基因的绝对含量，可按式（C.2）计算其在测试样品中的相对含量2转基因产品的含量（%）型直些品中结构特异性基因堕重旦笠100( c. 2 ) 测试样品中内源基因的拷贝数16 GB/T 19495.5-2004 附录D（规范性附录）转基因玉米Bt门实时荧光PCR检测方法D.1 范围本附录规定了转基因玉米Rtll实时荧光PCR定量检测方法。本

30、附录适用于食品、饲料、种子及其环境材料中转基因玉米Btll成分的实时荧光PCR定量检测。本附录也适用于转基因产品中转基因玉米Rt！成分定性PCR检测阳性结果的确证检测。D.2 原理采用实时荧光PCR技术和可特异性扩增转基因玉米Rtll结构特异性基因或品系特异性基因以及玉米内源基因的引物和两端标记荧光的探针，分别扩增测试样品DNA，并实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子），以获得稳定的标准曲线。根据外源基因（结构特异性基因或品系特异性基因）和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度），并由绝对含量计算转基因玉

31、米Btll在测试样品中的相对含量。如采用阳性标准分子时计算相对含量应使用转换系数。D.3 检测D.3. 1 结构基因检测D. 3. 1. 1 检测基因本方法检测转基因玉米lltll结构特异性基因crylACb）与adhlIVS6的边界序列和玉米内源zSSIIb基因。D. 3. 1. 2 定量检测低限绝对定量检测低限为20个拷贝。相对定量检测低限为0.5%。D. 3. 1. 3 主要试剂D. 3. 1. 3. 1 引物和探针检测转基因玉米Btll结构特异性基因及玉米内源zSSIIb基因的引物序列和探针序列见表D.1。表D.1检测转基因玉米Btll结构特异性基因的引物序列和探针序列基因名称序列PC

32、R反应体系终浓度1(nmol/L) 正向引物5AAAAGA CCA CAA CAA GCC GC-3 500 结构反向引物5 CAA TGC GTT CTC CAC C八八GTA CT-3 sec 特异探针3 FAM CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCATAMRA 3 200 止向引物5 CTC CCA ATC CT TGA CAT CTG C 3 500 zSSllb 反向寻i物5 TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG 3 500 探针5 FAM AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-TAMRA 3 20

33、0 注l, FAM,6 cadoxyfluoce,cein, TAMRA, 6 cacboxytetcamethylchodamine, 注2结构特异性基因扩增片段长度为127bp.zSSllb扩增片段长度为151忡。17 GB/T 19495.5-2004 D. 3. 1. 3. 2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表D.20 表D.2 实时荧光PCR反应体系邑反应体积加入量，25L DNA模板（50ng) 成分玉米基因组DIA加入量，2.5 L 成分加入量12.5 L I) Taq-DNA Polymernse, TaqMan Univernal Master Mix(2 Y 2) dUT

34、P uracil Iglycosylase,3）反应缓冲液（吉ROX);4) dNTP mix. 正向引物和反向引物见表D.l 探针见表D.l 注：ROXcarboxyX rhodmine TaqMan Univecsal Master M川是由All！公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具奇相同的效果，则可使用这些等效产品。D. 3. 1. 4 反应参数实时荧光PCR反应参数见表D.3. 表D.3实时荧光PCR反应参数a作用时间is温度去污染120 50 活化DNA合成酶和预变性600 95 PCR(40个循环）变性30 95

35、 延伸60 59 a Alll Prism 7700/7900 SDS仪器的反应参数。给出这一信息是为了方便丰标准的使用者，并不代表对该产品的认叮。如果其他等效产品具有相同的妓果，!Jltl可使用这些等效产品。D. 3. 1. 5 结果计算根据转基因玉米Btll结构特异性基因的绝对含量，可按式（0.1）计算其在测试样品中的相对含量：测试样品中结构特异性基因的拷贝数转基因产品的含量（%）二 100 ( 0.1) 测试样品中内源基因的拷贝数18 GB/T 19495.5-2004 附录E（规范性附录）转基因玉米GA21实时荧光PCR检测方法E.1 范围本附录规定了转基因玉米GA21实时荧光PCR定

36、量检测方法。本附录适用于食品、饲料、种子及其环境材料中转基因玉米GAZJ成分的实时荧光PCR定量检测。本附录也适用于转基因产品中转基因玉米GA21成分定性PCR检测阳性结果的确证检测。E.2 原理采用实时荧光PCR技术和可特异性扩增转基因王米GA21结构特异性基因或品系特异性基因以及玉米内源基因的引物和两端标记荧光的探针，分别扩增测试样品DJA，并实时监视lPCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增己知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子），以获得稳定的标准曲线。根据外源基因（结构特异性基因或品系特异性基因）和内源基因的标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量（拷贝数或浓度），并由绝

37、对含量计算转基因玉米GA21在测试样品中的相对含量。如l采用阳性标准分子时计算相对含量应使用转换系数。E. 3 检测E. 3. 1 结构特异性基因检测E. 3. 1. 1 检测基因本方法检测转基因玉米GA21结构特异性基因(OTP与mepeps的边界序列）和玉米内源zSSIIb基因。E. 3. 1. 2 定量检测低限绝对定量检测低限为20个拷贝。相对定量检测低限为0.1%。E. 3. 1. 3 主要试剂E. 3. 1. 3. 1 引物和探针检测转基因玉米GAZ！结构特异性基因及玉米内源zSS/lb基因的引物序列和探针序列见表E.L表E.1 检测转基因玉米GA21结构特异性基因的引物序列和探针序

38、列基因名称序歹1PCR反应体系终浓度/(nmol!L) 正向引物5 CAA CCC TCG GCA /CG TCA 3 500 结构反向引物5 A IC CGG TTG GA/ /GC GAC TT 3 500 特异探针5人FAM-/AGG八TCCC GTG CAT GGC CG TAMRA 3 200 5 CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C习500 函zSSI/b 引物5 TCG ATT TCT ere TTG GTG八CAGG - 3 500 探针5FAM-.G仁.气GTCAGA GCeccin. TAMR，气：6cachoxytetrnmethylchodamin

39、e, 注2结构特异性基冈扩增片段长度均121hp.日ACCg8墓园扩增片段长度为104忡。23 GB/T 19495.5-2004 G. 3. 1. 3. 2 反应体系实时荧光PCR反应体系见表G.2。表G.2实时荧光PCR反应体系总反应体积加人量，25L DNA模板成分：油菜基因组DNA加入量：5L 成分加入量，12.5 L ) Taq DNA-Polymernse; TaqMan Umvecoal Mas tee Mix(2 X ) 2) dUTP uracil N glycosylase; 3）反应缓冲液（吉ROX);4) d:.JTP mix, 正向引物和反向引物见表G.l 探针见表G

40、I 注：ROXcacboxyX chodmine a TaqMan Univernal Mastec Mix是由AB!公司提供的产品的商品名。给出这信息是为了方便丰标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。G. 3. 1. 4 反应参数实时荧光PCR反应参数见表G.3, 表G.3 实时荧光PCR反应参数作用时间Is温度去污染120 50 活化DNA合成酶和预变性300 95 PCR(40个循环）变性15 95 延伸60 60 a AB! Pcism 7700/7900 SDS仪器的反应参数。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不代表对该产品

41、的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。G. 3. 1. 5 结果计算根据转基因油菜RT73结构特异性基因的绝对含量，可按式（G.l）计算其在测试样品中的相对含量转基因产品的含量（%）二测试样品中结构特异性基因的拷贝数100-mportant plant spe cies. Plant Mol. Biol. Rep. 9, 208 218. 7 IRMM Certified Reference Material Reports and Certificates. http /www. irmm. jrc be/rm/ certreports. html. 8 Hcrnan

42、dcz,M. ,et al. (2004). Developmert and comparative validation of four maize specific reference genes for real time PCR based quantification. Manuscript in preparation. 9 Arumugunathan,K. ,Earle ED. ,(1991). Nuclear DNA content of some important plant spe cies. Plant Mol Biol Rep 9,208-218. 10 Jaenic

43、ke Despres, V. ,Buckler,E. S. ,Smith,B. D. ,Gilbert,M. T. P. ,Cooper, A. ,Doebley, . and Piiiibo, S. ( 2003). Early Allelic Selection in Maize as Revealed by Ancient ON A. Sci ence 302, 1206 1208. 11 Hernandez, M,Rio,A. , Esteve, T. , Prat,S. &. Pla, M. (2001). A rapeseed specific gene, Ace tyl CoA

44、carboxylase, can be used as a reference for qualitative and real time quantitative PCR detection of transgenes from mixed food samples 1. Agric. Food Chem 49 3622 3627 12 Arumugunathan, K., Earle. E. D., ( 1991 ). Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol Biol. Rep. 9-208 218. 1

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47、Quantitation of Genetically ModifiedMaize and Soybean Using New Reference Molecules. 1 AOAC Int. 2002,85,1119 1126. 16 Instruction Manual for Testing and Analysing Genetically Modified Food Quantitative PCR ,Japanese Agricultural Standard Testing and Analysis Handbook Series (Centre for Food Quality

48、, Labelling and Consumers Services,Saitama,JAPAN). 2002. 17 Testing for Foods Produced by Recombinant DNA Techniques by Ministry of Health, Labor and Welfare (Ministry of Health,Labour and Welfare,Japan) ,2002. 25 GB/T 19495.5-2004 26 18 Further the method has been published the Guideline of Detection Methods of Genetically Modified Foods by Korean Food and Drug Administration, Korea 19 Testing Manual for Genetically Modified Agricultural Produc