DB63 T 1269-2014 动物疫病监测样品采集、保存及运送技术规范.pdf

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1、ICS 11.220 B 41 备案号：41686-2014 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 12692014 动物疫病监测样品采集、保存及运送 技术规范 2014 - 03 03 发布 2014 - 03 - 15 实施 青海省质量技术监督局 发布 DB63/T 12692014 I 前 言 本标准的编写符合GB/T 1.12009给出的规则。 本标准由青海省农牧厅提出并归口管理。 本标准起草单位：青海省动物疫病预防控制中心。 本标准起草人：傅义娟、王生祥、王云平、林元清、李秀英、齐青丽、都占林、盛宗华。 DB63/T 12692014 1 动物疫病监测样品采集、保存及运送技术规范

2、 1 范围 本标准规定了动物疫病监测样品（病料）的采集注意事项、采样前的准备工作、样品采集及保存、 样品编号、采样单填写、样品运送方法。 本标准适用于病原学、血清学、组织病理学等实验室检测、诊断所需样品（病料）的采集、保存和 送检。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18635 动物防疫 基本术语 GB/T 18639 狂犬病诊断技术 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 NY/T 765 高致病性禽流感 样品采集、保存及运输技术规范 3

3、 术语和定义 下列术语和定义适应于本标准。 3.1 动物疫病监测 调查动物群体中某种疫病或病原的存在情况。 3.2 样品 取自动物或环境，拟通过检验反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。 3.3 病料 来自患病或可疑患病动物的被（待）检材料。 4 采样注意事项 4.1 谨慎取样：遇有病死动物，先排除炭疽后，再进行解剖取样。 4.2 及时取样：动物死后应尽快剖检取样，否则尸体腐败，难以采到合格的样品。 4.3 无菌取样：采样所需器具均应事先消毒，不同病料不得混装于同一容器内。 4.4 合理取样：取材时应根据不同的疫病和检验目的，采取相应的病料。 4.5 注意安全：采样时，应注意个人的安全

4、防护，同时也要注意防止污染周围环境。 DB63/T 12692014 2 5 采样前的准备工作 5.1 器械准备 冷藏箱、解剖刀，剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉，注射器、试管、离心管、试管架、平皿、西林瓶、 样品袋、玻片、无菌棉拭子、冰袋、封条、探杯等。 5.2 器械消毒 采样用具事先应煮沸或高压灭菌。 5.3 记录用品 不干胶标签、签字笔、记号笔、采样单、记录本等。 5.4 保存液 阿氏液、50%甘油盐水缓冲液、pH7.4磷酸盐缓冲液（P BS液），10%福尔马林固定液。 5.5 人员防护用具 防护服、防护帽、一次性口罩、一次性手套、护目镜、胶鞋等。 6 样品采集及保存 6.1 血液 6.1.1

5、 采血部位 猪常用采血部位是耳缘静脉和前腔静脉；禽类可在翅静脉或心脏采血；牛、羊常在颈静脉采血，牛 也可在尾静脉采血；兔可从耳背静脉、颈静脉或心脏采血；啮齿类动物可从尾尖采血，也可从眼窝内的 血管丛采血。 6.1.2 采血方法 对采血部位剪毛或拔毛，先用碘酒消毒，再用75%酒精脱碘，采血完毕，用干棉球压迫止血。 6.1.3 血液样品的制备 6.1.3.1 血清 待血液凝固，血清自然析出后取出。也可用离心机2500r/min3500r/min离心5min8min。若能及 时检测，可将血清放于04冰箱冷藏，若暂时不检测，须置 -20冰箱冷冻保存，但要避免反复冻 融。 6.1.3.2 全血（抗凝血）

6、 样品中加入抗凝剂。抗凝剂可用阿氏液、5%枸橼酸钠溶液等，也可将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶 内，振摇脱去纤维蛋白。全血样品不能冻结保存，以防溶血。 6.2 组织脏器 6.2.1 用于病原分离的组织样品 DB63/T 12692014 3 以无菌技术采集组织样品，分别放入灭菌容器内，标记后冷藏送往实验室。 6.2.2 用于病理组织学检验的组织样品 样品必须新鲜，选取病变典型的部位，连同健康组织一同用锋利的刀具切下，立即放入10倍于组织 块的10%福尔马林溶液中固定。 固定器具避免使用金属材质。 组织块厚度不超过0.5cm， 面积在2cm 2 3cm 2 之间。组织块切忌挤压、刮摸和用水洗。如作冷

7、冻切片用，则将组织块放在04容器中，尽快送往 实验室。 6.3 牛、羊 O-P 液（食道-咽喉部位分泌物） 被检动物在采样前禁食(可饮水)12h，以免反刍胃内容物严重污染O-P液。采样探杯在使用前经0.2 柠檬酸或2氢氧化钠浸泡5min，再用自来水冲洗。每采完一头动物,探杯要重复进行消毒和清洗。采 样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10cm15cm处，轻轻来回移动2次3次，然后将探 杯拉出，如采集的O-P液被反刍胃内容物严重污 染，要用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。采集 8mL10mL O-P液，倒入含有等量磷 酸盐缓冲液的灭菌瓶中，加盖密封 后充分摇匀，标记后放入冷藏箱 及

8、时送检，若不能及时送检应转往-60冰箱冷冻保存。 6.4 家禽泄殖腔拭子和咽喉拭子 取无菌棉签，插入禽口腔至咽的后部直达喉气管，慢慢旋转，沾上气管分泌物或将棉拭子插入泄殖 腔约1.5cm2cm，旋转沾上粪便，将拭子的样品端剪下，置于装有抗生素的PBS溶液的小塑料离心管中， 封口，做好标记。 6.5 水泡皮、水泡液 若水泡皮表面有污物，可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。用灭菌注射器抽 取水泡中的水泡液装入灭菌小瓶中，若水泡已破裂，剪取新鲜水泡皮放入灭菌小瓶中,加2倍体积的50 甘油磷酸盐缓冲液(pH7.4), 加盖密封，尽快冷冻送检。 6.6 皮肤 皮肤若有丘疹、结节、脓包、坏

9、死等病变，可直接剪取放入灭菌容器。如做螨等外寄生虫检查，则 在病变皮肤和健康皮肤的交界处，即螨活动旺盛的地方，用小刀与皮肤表面垂直刮取皮屑，直到皮肤轻 微出血，接取皮屑供检验。 6.7 尿液 在动物排尿时，用洁净的容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取 尿液。也可用导管导尿或膀胱穿刺。采得的尿液应立即送实验室，在室温中不可久置。 6.8 粪便 小动物先以酒精棉擦净肛门四周的污物，用灭菌直肠棉拭伸入直肠深处蘸取粪便，放入盛无菌缓冲 盐水或肉汤的试管内。大动物可从直肠直接采取，先将肛门周围皮肤清洗消毒，再戴上长筒手套伸入直 肠深部掏取少量粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻下

10、压，刺激排粪。采好的粪样须立即冷藏，及时转 送到实验室检验。 6.9 脓汁 DB63/T 12692014 4 未破口的脓肿可在局部剪毛并以碘酊消毒后，用灭菌注射器抽取脓汁。已破口脓灶应先消毒周围组 织，除去表层脓液后，以无菌纱布或棉拭蘸取深部脓汁，放入灭菌容器内。 6.10 乳汁 先用消毒水清洗和消毒乳房、乳头及采样者的手，然后将最初挤出的乳汁弃去，再采集适量乳汁于 灭菌容器内，加塞密封，编号后冷藏运送。进行血清学检验的乳汁避免冻结、加热或强烈震动。 6.11 流产物及生殖道分泌物 用灭菌棉拭子从阴道深部或子宫颈采集分泌物，立即置于 无菌肉汤或PBS等溶液内，冷藏送至实验 室。采取公畜精液时

11、，可清洗消毒阴茎皮肤后，以人工采精法将精液收集于灭菌容器内。若有流产胎儿， 可将整个胎儿，用塑料薄膜或数层不透水的油纸包紧，装入放有冰袋的密闭容器中，立即送往实验室。 6.12 骨 应将附着的肌肉和韧带等全部除去，表面撤上食盐，然后用浸过防腐消毒液的纱布包裹，装于不渗 漏的容器内送到实验室。 6.13 肠及肠内容物 选择病变明显的肠管，用线结扎两端，自结扎线以外剪下放入容器内。也可用吸管扎穿肠壁，从肠 腔内吸取内容物，放入盛有灭菌的30%甘油盐水缓冲保存液中送检。 6.14 脑 做病毒检查，可将脑浸入灭菌的30%甘油盐水缓冲保存液或将整个头部割下，以浸过消毒液的纱布 包裹，置于不漏水的容器内冷

12、藏送检。做疯牛病和羊痒病检测脑组织的采集和保存方法见规范性附录C。 做狂犬病内基氏小体检查用脑组织的采集和保存方法见GB/T18639。 6.15 脊髓液 6.15.1 颈椎穿刺法：采样前，常规消毒术部和用具。使用特制的专用穿刺针，穿刺点为环枢孔。将动 物站立或横卧保定， 使其头部向前下方屈曲， 穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入。 将针体刺入蛛网膜下腔， 立即拔出针芯，脑脊髓液自动流出或点滴状流出，盛入消毒容器内，大型动物颈部穿刺一次采集量约 35mL70mL。 6.15.2 腰椎穿刺法：穿刺部位为腰荐孔。动物站立保定，术部剪毛消毒后，用专用的穿刺针刺入，当 刺入蛛网膜下腔时，即有脑脊髓液滴状滴出

13、或用消毒注射器抽取，盛入消毒容器内，大型动物腰椎穿刺 一次采集量约 15mL30mL。 6.16 胃液 对于大动物，胃液可用多孔的胃管抽取。将胃管送入胃内，其外露端接在吸引器的负压瓶上，加负 压后，胃液即可自动流出 。 6.17 瘤胃内容物 反刍动物在反刍时，当食团从食道逆入口腔时，立即开口拉住舌头，另一只手深入口腔即可取出少 量的瘤胃内容物。 6.18 环境样品 DB63/T 12692014 5 为监测环境卫生或调查疫病，也可从遗弃物、通风管、下水道、孵化场、屠宰场等采集环境样品。 将固体平面培养基暴露静置于空气中，可采集空气中的微生物。 7 样品编号 对样品进行连续性，统一性编号，确保样

14、品在任何时候都具有唯一性标识。包装物上的编号和采样 单上的编号要一致。样品编号由区域名、畜种名和样品号三部分组成，每组成部分间由连字符连接。其 中区域名和畜种名用汉语拼音字母的第一个大写字母来标记，如大通县猪1号样品可表示为DT-Z-01，曲 麻莱县牛25号样品可表示为QML-N-25，以此类推。 XXX-XXX-XXX 样品号 畜种名 区域名 8 采样单填写 见附录A。 9 样品运送 9.1 疑似高致病性禽流感组织样品、血清及咽喉-泄殖腔拭子的运送见 NY/T765 高致病性禽流感 样 品采集、保存及运输技术规范。 9.2 疑似口蹄疫组织样品、血清及 O-P 液样品的运送见 GB/T1893

15、5 口蹄疫诊断技术。 9.3 其他样品运送原则及要求： 样品采集后应于 24h 内冷藏送往实验室，否则应将样品冷冻保存（有特殊保存要求的样品除 外），并以此状态运送； 样品的包装要防水、防漏、密封性良好，以防液体样品泄漏； 样品与容器间应填充防震材料，以防玻璃容器破裂； 容器外包装要加贴生物安全警示标识，提示用语等。 DB63/T 12692014 6 附 录 A （规范性附录） 采样登记表 表A.1 动物疫病应急检测采样登记表 采样单位（盖章）： 采样人 联系电话 采样地点 采样日期 畜主/养殖场名称 采样动物种类 样品名称 样品数量 临床发病情况：（说明养殖方式、存栏数、发病时间、发病数、

16、死亡数、临床症状等） 病理剖检情况： 免疫、治疗情况：（说明用过何种疫苗、疫苗生产厂家、是否治疗、用药情况等） 备注：（要求做何种试验等） 表A.2 动物疫病常规监测采样登记表 采样单位（盖章） 样品 编号 乡镇名 村社名 畜主/ 养殖场名 动物 种类 存栏数 样品 种类 免疫 时间 疫苗 种类 生产 厂家 预检测 项 目 B DB63/T 12692014 7 附 录 B （资料性附录） 保存液的配制 B.1 阿氏（A1severs)液 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠（Na 3C6H5O72H 2O） 0.8g 柠檬酸 0.055g 氯化钠 0.42g 加蒸馏水至100mL，溶解后调pH值至6

17、.1，69kPa l5min高压灭菌，4保存备用。 B.2 PH7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS） （O.01mol/L，PH7.4） 氯化钠 8.0g 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.2g 磷酸氢二钠（Na 2HP0412H 20） 2.9g 氯化钾 0.2g 将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后 ，再定容至1000mL，调PH值至7.4，高压 消毒灭菌112Kpa 20min，冷却后，保存至4冰箱中备用。 B.3 棉拭子用抗生素PBS(病毒保存液) 取上述PBS液，按要求加入下列抗生素：喉气管拭子用PBS液中加入青霉素(2000IU/mL)、链霉素 (2mg/mL)、丁胺卡那

18、霉素(1O 00IU/mL)、制霉菌素(1O00 IU/mL)。粪便和泄殖腔拭子所用的PBS中抗生素 浓度应提高5倍。加入抗生素后应调PH值至7.4。在采样前分装小塑料离心管，每管中加这种PBS 1.0mL 1.3mL，采粪便时在西林瓶中加这种PBS 1.0mL1.5mL，采样前冷冻保存。 B.4 50甘油盐水缓冲液 甘油 50mL 氯化钠 4.2g 磷酸二氢钾 1.0g 磷酸氢二钾 3.1g 0.02酚红 1.5mL 蒸馏水加至 100mL，加热溶化，校正 pH值为 7.6， 100kPa l5min灭菌，冰箱保存备用。 DB63/T 12692014 8 A C 附 录 C （资料性附录）

19、 固定液的配制 C.1 10%福尔马林固定液 无水磷酸氢二钠 6.5g 福尔马林（40%甲醛溶液） 100mL 磷酸二氢钾 4.0g 蒸馏水 加至1000mL DB63/T 12692014 9 B D 附 录 D （资料性附录） 疯牛病和羊痒病检测用脑组织的采集、保存和运送方法 D.1 采样工具 采样勺、样品杯、剪刀、手套、口罩、工作服、记号笔、采样单、冰袋、吸水纸、胶带、泡沫箱。 D.2 采样步骤 D.2.1 3岁以上的牛和18月龄以上的羊方可采样，但如果该动物为BSE或痒病风险动物则无年龄限制。 D.2.2 在平整的地面上倒置牛/羊头,在枕骨大孔处用剪刀剪开脑硬膜，然后用一个手指伸入枕骨

20、大孔 中，沿着延脑（延髓）转一周，切断延脑与头骨之间相连的神经和血管，从延脑腹侧将采样勺插入枕骨 大孔中，插入时采样勺要紧贴枕骨大孔的腔壁，以免损坏延脑组织。采样勺插入的深度约为5cm7cm （采羊脑时插入深度约为4cm） ， 然后向上扳勺子手柄， 同时往外抠出脑组织和勺子， 延脑便可完整取出。 注意：尽量保护好延脑“三叉口”处（脑闩部）组织的完整性。 D.2.3 将脑组织放入样品杯中，拧紧杯盖，编号后放入盛有冰袋的泡沫箱中，5h之内转入冰柜中冷冻， 样品至少要冷冻24h才能送往BSE检测实验室。 D.3 样品运送 准备好带盖的结实的泡沫箱，先在箱的底部铺上一层吸水纸，之后放入冷冻好的样品，最后在样品 上面放几块冰袋，盖紧箱盖。用大号的透明胶带封好箱口，再横向打好包，箱子外面标明“易碎勿压” 以及向上的“箭头”等字样，打好包的样品必须及时发送，确保4d之内送到实验室。