DB32 T 3680-2019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法.pdf

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1、ICS 65.020.20 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3680 2019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 The detection of pathogen for Maize Rough Dwarf disease by dot immuobinding assay method 2019 - 12 - 04 发布 2019 - 12 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3680 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院 提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本

2、标准主要起草人：周彤、杜琳琳、周益军、孙枫、兰莹、李硕、范永坚。 DB32/T 3680 2019 1 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 1 范 围 本标准规定了 大麦、小麦、 玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法。 本标准适用于 大麦、小麦、 玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原的检测。 2 斑点酶联免疫吸附检测原理 硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。将抗原吸 附于硝酸纤维素膜后，可利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应。当加入 抗原的 特异性抗体后，即可与 膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的二抗，使 酶 标记通过 二抗 和相应抗体的结合

3、间接地交联于纤 维素膜上。最后加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产 物 ， 呈现斑点状着色。 3 仪器设备与试剂材料 3.1 仪器设备 台式离心机（ 5 000 r/min）；具盖塑料离心管： 200 L；培养皿（直径为 90 mm）；塑料盒（规格 为 100 mm50 mm）。 3.2 试剂材料 3.2.1 试验用水均为蒸馏水，使用的化学试剂未作说明均为分析纯级别。 3.2.2 包被缓冲液： 0.05 mol/L， pH值 9.6。称取 1.59 g Na2CO3和 2.93 g NaHCO3，加水定容至 1 000 mL， 用 HCl调 pH值至 9.6， 4 保存。

4、3.2.3 磷酸盐 Tween 20缓冲液（ 0.01M PBST）： 0.01mol/L， pH=7.5。称取 40 g NaCl, 1 g KCl, 1 g KH2PO4 和 15 g Na2HPO4，加水定容至 5 000 mL，用 HCl调节 pH值至 7.5，再加入 2.5 mLTween 20， 4 保存。 3.2.4 磷酸盐缓冲液（ 0.02M PBS）： 0.02 mol/L， pH值 7.5。称取 40 g NaCl， 1 g KCl， 1 g KH2PO4， 15 g Na2HPO4，加水定容至 2 500 mL， 4 保存。 3.2.5 1%脱脂奶粉 封闭液： 1 g脱脂

5、奶粉加入 100 mL磷酸盐 Tween20缓冲液中， 4 保存。 3.2.6 辣根过氧化物酶固体显色底物溶液： 6 mg的 4-氯 -1-萘酚加入 2 mL无水乙醇中， 4 保存备用，使 用时加入 10 mL 磷酸盐缓冲液中，再加入 10 L H2O2。 3.2.7 BCIP/NBT显色底物：碱性磷酸酶底物显色试剂盒。 3.2.8 单克隆抗体（单抗）：玉米粗缩病病原 RBSDV单克隆抗体，效价为 1:5 000 1:10 000， 20 保 存。 3.2.9 酶标二抗： Goat Anti-Mouse IgG Antibody， HRP（检测灰飞虱）， Goat Anti-Mouse IgG

6、 Antibody, AP（检测植物）， 20 保存。 4 植物 样品 检测 DB32/T 3680 2019 2 4.1 样品 制备 4.1.1 田间采集新鲜 的 大麦、小麦、 玉米 植株的茎秆 或叶片 ，装至无菌样品袋中。标记样品编号、取样 时间、取样地点， 48 h内送至实验室，放置 -20冰箱保存备用，避免反复冻融。 4.1.2 取 0.5 mg大麦、小麦或 玉米 的茎秆 或叶片研磨 成 粉末，碳酸盐包被液稀释 100倍，离心（ 5 000 r/min） 3 min，取上清液备用。 4.2 封闭 4.2.1 预先用铅笔将硝酸纤维素膜（ NC膜）划成 5 mm5 mm的正方格，取 2.0

7、 L 4.1获得的上清液点于 NC膜上正方格 中心 （以不超出正方格一半为准） ； 同时取 2.0 L已采用本方法测定为感染玉米粗缩病 的玉米 汁液点 于膜上预先标记好 的 正方格内，作为阳性对照 ，取 2.0 L已采用本方法测定为 不感染玉米 粗缩病 的玉米 汁液 点于膜上预先标记好的正方格内， 作为阴性对照， 将 膜置于室温晾干 。 4.2.2 将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培养皿，加入 1%脱脂奶粉封闭液，要求将膜完全浸没， 37 轻轻摇 晃，封闭 30 min。 4.3 孵育 4.3.1 用镊子压住膜倒弃封闭液， 将 单抗和 1%脱脂奶粉封闭液按 1:5 000 1:10 000比例稀释配

8、制孵育液， 将膜完全浸入孵育液， 37 轻轻摇晃，孵育 1 h 1.5 h。 4.3.2 用镊子压住膜倒弃孵育液，加入磷酸盐 Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜 3 min 5 min，用镊子压住膜倒弃洗液，重复洗膜三次。 4.4 二抗孵育 4.4.1 用镊子压住膜倒弃洗液， 将 二抗 （ Goat Anti-Mouse IgG Antibody, AP） 和封闭液按 1:5 000比例稀 释配制孵育液，将膜完全浸入二抗孵育液， 37 轻轻摇晃，孵育 1.5 h 2 h，再用镊子压住膜倒弃二抗 孵育液 。 4.4.2 加入磷酸盐 Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗

9、膜 3 min 5 min，用镊子压住膜倒弃洗 液，重复洗膜三次。 4.5 显色 用镊子压住膜倒弃洗液，加入 BCIP/NBT显色底物溶液， 37 静置显色 30 min； 蒸馏水冲洗膜，室 温晾干。 4.6 结果 判定 显色后首先观察对照的颜色反应，阳性对照应显蓝紫色，阴性对照应不显色，再观察样品的颜色反 应，如果显蓝紫色，则认定 植株 感染了 玉米粗缩病，如果不显色，则认定未感染玉米粗缩病 。 试验结果 记载表 见附录 A。 5 灰飞虱带毒率检测 5.1 样品 制备 5.1.1 采集 灰飞虱高龄若虫或成虫 ， 虫量不少于 100头，装 至塑料瓶中。 样品储存 方法 同 4.1.1。 5.1

10、.2 单头灰飞虱置于离心管中，加 100 L碳酸盐 包被缓冲液 ， 用牙签捣烂，离心（ 5 000 r/min） 3 min， 取灰飞虱提取液备用。 DB32/T 3680 2019 3 5.2 封闭 同 4.2。 取 2.0 L已采用本方法测定为带毒 的 灰飞虱提取液作为阳性对照 ，取 2.0 L已采用本方法测 定 不带毒的 灰飞虱提取液 ， 作为阴 性对照 。 5.3 孵育 同 4.3。 5.4 二抗孵育 同 4.4。二抗选 Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP。 5.5 显色 用镊子压住膜倒弃洗液，加入辣根过氧化物酶固体显色底物溶液， 37静置显色 30 m

11、in；蒸馏水冲 洗膜，室温晾干。 5.6 结果 判定 5.6.1 灰飞虱带毒判定 同 4.6。 5.6.2 带毒率计算 按照 公式 1计算 灰飞虱带毒率， 结果保留到小数点后一位 。 试验结果记载表 见附录 B。 100Nc tc NL 公式 1 式中 ： Lc 灰飞虱 带毒率，单位为百分率（ %） ； Nc 带毒 灰飞虱虫量； Nt 测定 灰飞虱总虫量。 DB32/T 3680 2019 4 附录 A （规范性附录） 植物样品检测结果记录表 植物样品检测结果记录表 A.1。 表 A.1 植物样品检测 结果记录表 样品采集日期 样品采集地点 测定样品数量 （株） 阳性样品数 （株） 阴性样品数 （株） 鉴定技术负责 人 DB32/T 3680 2019 5 附录 B （规范性附录） 灰飞虱带毒率测定结果记录表 灰飞虱带毒率测定记录表 B.1。 表 B.1 灰 飞虱带毒率测定结果记录表 灰飞虱采 集日期 灰飞虱采集 地点 灰飞虱代 次 测定样品数量 （头） 阳性样品数 （头） 阴性样品数 （头） 带毒率 （ %） 鉴定技术 负责人 _