ISO TS 29843-2-2011 Soil quality - Determination of soil microbial diversity - Part 2 Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA ex.pdf

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1、Qualit du sol Dtermination de la diversit microbienne du sol Partie 2: Mthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) en utilisant la mthode simple dextraction des PLFA Soil quality Determination of soil microbial diversity Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using

2、 the simple PLFA extraction method ISO 2011 Premire dition 2011-09-15 ISO/TS 29843-2 SPCIFICATION TECHNIQUE Numro de rfrence ISO/TS 29843-2:2011(F)ISO/TS 29843-2:2011(F)DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2011 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publicatio

3、n ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Gen

4、eva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Publi en Suisse ii ISO 2011 Tous droits rservsISO/TS 29843-2:2011(F)Sommaire Page Avant-propos .iv Introduction v 1 Domaine dapplication . 1 2 Rfrences normatives 1 3 Symboles et termes abrgs ( lexception des

5、 produits chimiques et des ractifs) 1 4 Principe 1 5 Matriaux dessai . 2 5.1 Sol 2 5.2 Ractifs 2 5.3 Appareillage 4 6 Modes opratoires 5 6.1 Extraction des lipides (extraction de Bligh-Dyer) . 5 6.2 Sparation des lipides par colonne SI . 5 6.3 Drivation Transmthylation Purification . 5 6.4 Analyse P

6、LFA . 6 Bibliographie 7 ISO 2011 Tous droits rservs iiiAvant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO.

7、 Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique inter

8、nationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adop

9、ts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Dans dautres circonstances, en particulier lorsquil existe une demande urgente du march, un comit technique peut dci

10、der de publier dautres types de documents: une Spcification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) reprsente un accord entre les experts dans un groupe de travail ISO et est accepte pour publication si elle est approuve par plus de 50 % des membres votants du comit dont relve le groupe de travail; un

11、e Spcification technique ISO (ISO/TS) reprsente un accord entre les membres dun comit technique et est accepte pour publication si elle est approuve par 2/3 des membres votants du comit. Une ISO/PAS ou ISO/TS fait lobjet dun examen aprs trois ans afin de dcider si elle est confirme pour trois nouvel

12、les annes, rvise pour devenir une Norme internationale, ou annule. Lorsquune ISO/PAS ou ISO/TS a t confirme, elle fait lobjet dun nouvel examen aprs trois ans qui dcidera soit de sa transformation en Norme internationale soit de son annulation. Lattention est appele sur le fait que certains des lmen

13、ts du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO/TS 29843-2 a t labore par le comit technique ISO/TC 190, Qualit du so

14、l, sous-comit SC 4, Mthodes biologiques. LISO/TS 29843 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre gnral Qualit du sol Dtermination de la diversit microbienne du sol: Partie 1: Mthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) et par analyse des lipides ther phospholipidiques (P

15、LEL) Partie 2: Mthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) en utilisant la mthode simple dextraction des PLFA ISO/TS 29843-2:2011(F)iv ISO 2011 Tous droits rservsIntroduction Les phospholipides sont des composants essentiels des membranes de toutes les cellules vivantes. Extraits dch

16、antillons de sol sous forme dacides gras (PLFA: acides gras phospholipidiques) ou de chanes latrales isoprniques liaison ther (PLEL: lipides ther phospholipidiques), ils apportent des connaissances quantitatives et qualitatives relatives la biomasse microbienne viable/active du sol. Les enzymes cell

17、ulaires hydrolysent et librent le groupe phosphate dans les minutes ou les heures qui suivent la mort cellulaire (Rfrence 1). Le dosage des PLFA et des PLEL totaux fournit une mesure quantitative de la biomasse viable du sol, cest-dire des micro-organismes des trois domaines de la biosphre (bactries

18、, champignons et archaebactries). Les PLFA et les PLEL peuvent galement permettre une diffrentiation taxonomique lintrieur de communauts microbiennes complexes (Rfrences 2 et 3). Cette approche est dsormais bien tablie dans le domaine de lcologie des sols et sert doutil phnotypique. Elle est donc co

19、mplmentaire aux approches gnotypiques (gntique molculaire) pour dterminer la diversit microbienne. En plus des descriptions taxonomiques, la technique PLFA permet de dterminer les modifications physiologiques au sein des consortiums microbiens. Par exemple, les PLFA mononiques 16:1 7c et 18:1 7c son

20、t progressivement convertis en acides gras cyclopropyliques cy17:0 et cy19:0 dans les bactries Gram-ngatives en rponse aux contraintes environnementales (Rfrence 4). Il existe diffrentes mthodes de dosage des acides gras prsents dans le sol. Ces mthodes prsentent, lors de leur application, des nivea

21、ux de complexit variables et permettent dobtenir diffrents niveaux de rsolution concernant la description des communauts microbiennes du sol. L ISO/TS 29843-1 traite de la mthode gnralement appele mthode tendue dextraction des PLFA tandis que la prsente partie de lISO/TS 29843 traite de celle gnrale

22、ment appele mthode simple dextraction des PLFA (Rfrences 5 et 6). La prsente partie de lISO/TS 29843 traitant de la mthode simple dextraction des PLFA est accessible la plupart des laboratoires danalyse et de recherche concerns par les sciences de la terre. Cette mthode peut tre utilise pour un larg

23、e ventail de sols. Elle fournit une mesure de la grande diversit de la communaut microbienne du sol un niveau phnotypique. Elle peut tre applique lestimation de la biomasse et peut tre utilise pour diffrencier les communauts microbiennes dans diffrents chantillons de sol ( laide dune mthode statisti

24、que adapte). Cette mthode est particulirement adapte la dtection des modifications rapides de la structure de la communaut microbienne du sol. Elle peut galement tre utilise pour une description sommaire des groupes microbiens prsents dans les chantillons de sol (par exemple les bactries Gram-positi

25、ves, les actinomyctes, les champignons). Le Tableau 1 (adapt de la Rfrence 5) prsente une comparaison de la sensibilit des techniques PLFA tendue et PLFA simple. ISO/TS 29843-2:2011(F) ISO 2011 Tous droits rservs vTableau 1 Comparaison de la sensibilit des techniques PLFA simple et tendue pour la ca

26、ractrisation des changements dans la composition des communauts microbiennes Proprit PLFA (simple) PLFA (tendue) Aptitude diffrencier deux communauts ( laide de mthodes statistiques plusieurs variables) Oui Oui Applicabilit pour lestimation de la biomasse Oui Oui Aptitude rpertorier tous les composa

27、nts simples de la structure dune communaut entire (empreinte) Non Oui Aptitude rpertorier les acides gras autres que les acides gras liaison ester Non Oui Estimation du nombre dacides gras dans les chantillons de sol 50 200 400 Capacit doser la liaison des acides gras aux lipides dans la molcule Oui

28、, liaison ester (EL) Oui, liaison ester (EL), sans liaison ester (NEL) Capacit dtecter les acides gras dfinis de faibles concentrations dans lextrait de sol Non Oui Capacit dtecter les acides gras inhabituels dans lextrait de sol Non Oui Nombre de signatures disponibles dacides gras pour des organis

29、mes dfinis Peu Nombre lev Relation des acides gras rpandus dans le profil Importante Naturelle Aptitude identifier les organismes provoquant des changements dans la communaut microbienne Non Oui, dans lensemble La prsente mthode est drive de la premire mthode propose par la Rfrence 7 et modifie ultr

30、ieurement par la Rfrence 1. Cette mthode rvise a t largement utilise (Rfrence 8) et a galement t examine et compare la mthode tendue dextraction des PLFA dans des articles publis par des pairs (Rfrences 5 et 6). ISO/TS 29843-2:2011(F)vi ISO 2011 Tous droits rservsSPCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 29843-

31、2:2011(F)Qualit du sol Dtermination de la diversit microbienne du sol Partie 2: Mthode par analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA) en utilisant la mthode simple dextraction des PLFA 1 Domaine dapplication La prsente partie de lISO/TS 29843 spcifie une mthode simple permettant dextraire uniq

32、uement les acides gras phospholipidiques (PLFA) du sol. LISO/TS 29843-1 spcifie une mthode tendue permettant dextraire et de doser aussi bien les acides gras phospholipidiques (PLFA)que les lipides ther phospholipidiques (PLEL) du sol. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont ind

33、ispensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 10381-6, Qualit du sol chantillonnage Partie 6: Lignes directrices pour l

34、a collecte, la manipulation et la conservation, dans des conditions arobies, de sols destins lvaluation en laboratoire des processus, de la biomasse et de la diversit microbiens ISO/TS 29843-1, Qualit du sol Dtermination de la diversit microbienne du sol Partie 1: Mthode par analyse des acides gras

35、phospholipidiques (PLFA) et par analyse des lipides ther phospholipidiques (PLEL) 3 Symboles et termes abrgs ( lexception des produits chimiques et des ractifs) FA: acides gras EL-FA: acides gras liaison ester NEL-FA: acides gras sans liaison ester FAME: ester mthylique dacide gras w w : fraction ma

36、ssique deau contenue dans le sol, en grammes deau par grammes de sol sec (g/g) CG: chromatographie en phase gazeuse FID: dtecteur ionisation de flamme CLHP: chromatographie liquide haute performance 4 Principe Les lipides sont extraits en appliquant le mode opratoire dextraction de la Rfrence 7. Les

37、 extraits lipidiques sont fractionns en lipides neutres, glycolipides et phospholipides par chromatographie en phase liquide en utilisant une colonne de silice (colonne SI). Les phospholipides sont transforms en esters mthyliques dacides ISO 2011 Tous droits rservs 1gras (FAME) par hydrolyse alcalin

38、e douce. Les diffrents FAME sont mesurs par chromatographie en phase gazeuse. Une vue densemble schmatique des modes opratoires est illustre la Figure 1. Figure 1 Vue densemble schmatique de lanalyse PLFA selon la mthode simple dextraction 5 Matriaux dessai 5.1 Sol Prlever des chantillons de sol et

39、les prparer conformment lISO 10381-6. Dterminer la fraction massique deau contenue dans le sol, w w . Si les chantillons tamiss ltat frais ne sont pas analyss immdiatement, ils peuvent tre conservs 20 C ou stocks dans du chloroforme aprs extraction des lipides (voir 6.1). 5.2 Ractifs Au cours de lan

40、alyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue ou de qualit CLHP lorsque cela est spcifi. 5.2.1 Solvants organiques. 5.2.1.1 Actone, C 3 H 6 O (qualit CLHP). 5.2.1.2 Chloroforme, CHCl 3(qualit CLHP). ISO/TS 29843-2:2011(F)2 ISO 2011 Tous droits rservs

41、5.2.1.3 Hexane, C 6 H 14 . 5.2.1.4 Mthanol, CH 3 OH (qualit CLHP). 5.2.1.5 Tolune, C 7 H 8 . 5.2.2 Produits chimiques. 5.2.2.1 2,6-Di-tert-butyl-4-mthylphnol (BHT), C 15 H 24 O. 5.2.2.2 Acide citrique, C 6 H 8 O 7 , H 2 O. 5.2.2.3 Citrate trisodique, C 6 H 5 Na 3 O 7 , 2H 2 O. 5.2.2.4 Hydrate dacide

42、 silicique, SiO 2 , nH 2 O. 5.2.2.5 Sulfate de sodium anhydre, Na 2 O 4 S. 5.2.2.6 Hydroxyde de potassium, KOH. 5.2.2.7 Acide actique, C 2 H 4 O 2 . 5.2.2.8 Hydroxyde de sodium, NaOH. 5.2.2.9 Ester mthylique dacide nanodcanoque, C 20 H 40 O 2 . 5.2.2.10 Azote gazeux, N 2 . 5.2.3 Tampons et talons. 5

43、.2.3.1 Solution CM (chloroforme/mthanol), un mlange de chloroforme et mthanol dans un rapport de 1:2, ajouter le 2,6-di-tert-butyl-4-mthylphnol (BHT) (0,005 %). 5.2.3.2 Solution CB (tampon au citrate), constitue de ce qui suit: acide citrique monohydrate, 0,15 mol/l, 15,76 g de C 6 H 8 O 7 , H 2 O d

44、ans 500 ml deau; citrate trisodique, 0,15 mol/l, 22,06 g de C 6 H 5 Na 3 O 7 , 2H 2 O dans 500 ml deau; pour le pH 4, ajouter 59 ml de solution dacide citrique 41 ml de solution de citrate trisodique. 5.2.3.3 Solvant BD (Bligh et Dyer), un mlange chloroforme:mthanol:tampon au citrate dans un rapport

45、 de 1:2:0,8, ajouter le 2,6-di-tert-butyl-4-mthylphnol (BHT) (0,005 %). EXEMPLE (100 ml de chloroforme:200 ml de mthanol:80 ml de CB) + BHT. 5.2.3.4 Solution mthanolique de KOH, 0,2 mol/l, 0,56 g de KOH dans 50 ml de mthanol sec (sulfate de sodium anhydre), prpare extemporanment. 5.2.3.5 SE (solvant

46、 pour extraction), mlange dhexane et de chloroforme dans un rapport de 4:1 (fraction volumique). 5.2.3.6 Acide actique, 1 mol/l, 58 ml/l. Ajouter 58 ml dacide actique 750 ml deau distille et complter 1 l avec de leau distille. ISO/TS 29843-2:2011(F) ISO 2011 Tous droits rservs 35.2.3.7 Hydroxyde de

47、sodium, 0,3 mol/l, 12 g/l. Dissoudre 12 g dhydroxyde de sodium dans 750 ml deau distille et complter 1 l avec de leau distille. 5.2.3.8 talon interne (C19:0 FAME), 10 mg dester mthylique dacide nanodcanoque dans 1 ml de solution mre dhexane (dilution 1:100 avec de lhexane). 5.2.3.9 talon externe (BAME), ester mthylique dacide bactrien Mix Supelco TM#47080-U 1) . 5.3 Appareillage Matriel courant de laboratoire et ce qui suit. 5.3.1 Tubes en polyttrafluorothylne ou si