DB51 T 1421-2012 《动物犬恶丝虫检疫技术规范》.pdf
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1、 ICS 11.220 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 14212012 动物犬恶丝虫检疫技术规范 2012 - 03 - 30 发布 2012 - 05 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 14212012 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 生活特性 . . 1 5 形态特征 . . 2 6 检疫方法 . . 2 7 综合判定 . . 3 附录 A(资料 性附录) 犬恶丝虫微丝蚴图片 4 附录 B(资料 性附录) 试剂的配制方法 5 附录 C(资料 性附录) 犬恶丝虫虫体粗抗原制备 6 参
2、考文献 . 7 DB51/T 14212012 II 前 言 本标准由四川出入境检验检疫局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位:四川出入境检验检疫局、四川农业大学。 本标准主要起草人:余华、杨光友、严玉宝、胡娟、崔鹏博、周岷江。 DB51/T 14212012 1 动物犬恶丝虫检疫技术规范 1 范围 本标准规定了动物犬恶丝虫的检疫方法。 本标准适用于动物血液内犬恶丝虫微丝蚴及血清抗体的检测和检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适
3、用于本文件。 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 犬恶丝虫 Dirofilaria immitis 为双瓣科、恶丝属( Dirofilaria)的虫种,又称犬心丝虫( heart worm)。犬恶丝虫的成虫寄生于犬心脏的右心室及肺动脉(少数见于胸腔、支气管、皮下结缔组织等处)引起循环障碍、呼吸困难、贫血、猝死等症状,即犬恶丝虫病,属于一种丝虫病。除犬外,猫和多种野生动物以及人均可感染与发病。该病不仅危害犬猫等动物的健康,而且对人类健康亦构成威胁。 3.2 微丝蚴 Microfilariae 为犬恶丝虫的雌虫和雄虫交配后,雌虫胎生产出
4、的幼虫。微丝蚴通常生活于动物的外周血液中。 4 生活特性 犬恶丝虫寄生于犬、猫的右心室和肺动脉。中间宿主为蚊子(中华按蚊、白纹伊蚊、浅色库蚊等)。雌虫产出的微丝蚴进入外周血液内,在外周血液中可生存一年或一年以上,但被中间宿主吞噬以前不能进一步发育。夏季蚊子吸食动物血液,微丝蚴随血液进入蚊体内,在其体内约2周发育为第三期感染性幼虫。蚊刺吸犬、猫血液时,第三期幼虫从蚊子口器中逸出,迅速钻进动物宿主皮肤,在皮下结缔组织、肌间组织、脂肪组织和肌膜下发育,经第三次、第四次蜕皮成为童虫,然后进入静脉,移行到右心室及DB51/T 14212012 2 大血管内,继续发育为成虫。从蚊子叮咬感染到发育为成虫需6
5、7个月。成虫除寄生在右心室及肺动脉外,也可在后腔静脉、前腔静脉到肺动脉的毗连血管内寄生。在终宿主体内成虫可生存56年,并不断产生微丝蚴。 5 形态特征 5.1 微丝蚴 无鞘膜,大小为 218 329m5 7m,尾部细长,体内除含有体核外还具有神经环、排泄孔、排泄细胞、生殖细胞、肛孔及尾核。见附录 A。 5.2 成虫 虫体呈微白色,细长粉丝状。口由 6 个不明显的乳突围绕。雄虫长为 1220cm,后部呈螺旋状卷曲,有窄的尾翼膜,末端有尾乳突 11 对(肛前 5 对、肛后 6 对),交合刺 2 根,长短不等。雌虫长为25 30cm,尾端钝圆,阴门开口于食道后端。 6 检疫方法 6.1 设备和器械
6、光学显微镜、普通离心机(5000 r/min)、恒温培养箱、硝酸纤维素膜(NC膜),实验室其它常规器材。 6.2 试剂和材料 以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T 6682规定的二级水。 美蓝染色液; 包被缓冲液 CBS; BAS封闭液; PBS缓冲液; PBST 洗涤液; 底物溶液; 酶联葡萄球菌 A蛋白( HRP-SPA) 检测动物的犬恶丝虫抗体阳性血清; 检测动物的犬恶丝虫抗体阴性血清; 犬恶丝虫虫体粗抗原( 0.2 mg/mL)。 6.3 微丝蚴检测(改良柯氏试验) 按照NY/T 541“样品的采集”有关章节要求,每只待检动物取外周血 5 mL,在每 1 mL
7、抗凝血中加入 2%的甲醛 10 mL,混合后 1500 r/min离心 10 min,去上清液,取少量沉渣,美兰染色,镜检观察。 DB51/T 14212012 3 6.4 犬恶丝虫抗体检测( Dot-ELISA 法) 6.4.1 试剂、血清及犬恶丝虫虫体粗抗原制备 6.4.1.1 0.05 mol/L 的包被缓冲液 CBS( pH 9.6)制备见 B.2.1; 10 g/L 的 BSA 封闭液制备见 B.2.2; PBS ( pH7.4)缓冲液制备见 B.2.3; PBST 洗涤液制备见 B.2.4;底物溶液制备见 B.2.5。 6.4.1.2 按照 NY/T 54“样品的采集”有关章节要求
8、,每只待检动物采集血液 5 mL, 3 000 r/min 离心5 min,取上清(血清) ,备用。 6.4.1.3 犬恶丝虫虫体粗抗原制备见附录 C。 6.4.2 诊断膜制备 用铅笔在硝酸纤维素膜( NC膜)光滑面将膜划成 5 mm 5 mm小方块,将 NC膜在蒸馏水中浸泡 20 min,完全湿透后取出,室温晾干,备用。用0.05 mol/L的包被缓冲液CBS( pH 9.6)将犬恶丝虫虫体粗抗原原液稀释至 16.41 g/mL,备用。用微量加样器在小格中央滴加 1 L稀释好的虫体粗抗原, 37保温 30 min; 将包被好的 NC膜膜片浸入 10 g/L的 BAS封闭液中, 37封闭 50
9、 min。 将封闭好的膜片浸入 PBST洗涤液中泡洗 3次,每次 5 min。置室温晾干,即为诊断膜。可放入密闭干燥的塑料袋中备用。 6.4.3 操作步骤 6.4.3.1 用 PBS( pH7.4) 缓冲液将待检血清、 酶联葡萄球菌 A 蛋白 ( HRP-SPA) 分别按 1:150 和 1: 4 000稀释,备用。 6.4.3.2 将事先预备的诊断膜浸入稀释好的血清中,置 37,反应 60 min。 6.4.3.3 将诊断膜浸入 PBST 洗涤液中泡洗 3 次,每次 5 min,取出用滤纸吸干。 6.4.3.4 将诊断膜浸入稀释好的 HRP-SPA 溶液中,置 37,反应 60 min。 6
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