DB11 T 1053.3-2013 实验用鱼 第3部分 遗传质量控制.pdf

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1、ICS 65.020.30 B 44 备案号 :40368-2014 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 1053.3 2013 实验用鱼 第 3部分：遗传质量控制 Laboratory fish Part 3： Genetic quality control 2013 - 12 - 20发布 2014 - 04 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 1053.32013 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 遗传分类及命名原则 . 2 5 实验用鱼的繁殖方法 . 2 6 近交系实验用鱼的遗传质量监测 . 3

2、 7 封闭群实验用鱼的遗传质量监测 . 5 附录 A（资料性附录） 斑马鱼相关基因的命名原则 6 附录 B（资料性附录） 斑马鱼微卫星遗传标记的检测方法 8 附录 C（资料性附录） 斑马鱼 SNP遗传标记的检测方法 . 12 DB11/T 1053.32013 II 前 言 DB11/T 1053的本部分按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 DB11/T 1053实验用鱼分为六个部分： 第 1部分：微生物学等级及监测； 第 2部分：寄生虫学等级及监测； 第 3部分：遗传质量控制； 第 4部分：病理学诊断规范； 第 5部分：配合饲料技术要 求 ； 第 6部分： 环境条 件。 本部分为

3、 DB11/T 1053的第 3部分。 本部分 由北京市科 学技术 委员会提 出。 本部分 由北京市科 学技术 委员会归口 。 本部分 由北京市科 学技术 委员会组织 实施 。 本部分起草 单位 ： 国家人口计生 委科 学技术 研究所、中国科 学院水 生生物 研究所、中国药品 生物制 品检定 所、北京大 学。 本部分 主要起草 人： 崔宗斌、岳秉飞、孙德明、张博、孙荣泽 。 DB11/T 1053.32013 1 实验用鱼 第 3部分：遗传质量控制 1 范围 DB11/T 1053的本部分规定了 实验用鱼（斑马鱼和 剑尾 鱼）的遗传分类及命名原则、 实验用鱼的繁 殖方法 、近交系和封闭群的遗传

4、质量监测。 本部分 适用 于实验用鱼（斑马鱼和 剑尾 鱼）的遗传质量控制。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件的 应用 是必不可少 的。 凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的 版本 适用 于 本文 件。凡是不注日期 的引用文件，其最新版 本（ 包括所有的 修改单 ）适 用于 本文件。 GB 14923 2010 实验 动 物 哺乳 类实验 动物的遗传质量控制 3 术语和定义 GB 14923界 定的 ，以 及下列 术语和定义 适用本文件。 3.1 实验用鱼 laboratory fish 指经人工 饲养、 繁育，对其携带 的微生物及寄生虫实 行控制 ，遗传 背景明确或者来 源清楚 的用

5、 于 科 学 研究、 教学 、生 产、 检定以 及其 他科 学实验的鱼类。 3.2 近交系 inbred strain 在一个鱼群内 ，任何 个 体基因组中 98.6%以 上的等 位位 点 为纯 合 时定义为近交系。经 过20代 以上 的 全同胞兄妹 交配培育 而成 ，品系内所有 个 体都 可以 追溯到一对 共同的祖先 ，其 近交系数 （inbreeding coefficient）应大于 99%。 3.3 封闭群 (远交系) closed colony (outbred stock) 以 非 近亲 交配方 式进 行 繁殖的实验用鱼群 体， 在 不从外部引 入 新的基因的条 件下，经 过 4代

6、 以上的 繁殖， 该群 体称 为封闭群 ，亦称远 交系。 3.4 杂交群 hybrids 由 两 个不 同近交系 杂交 产生的后代 群体 。子一代简称 F1。 DB11/T 1053.32013 2 3.5 同源突变近交系 coisogenic inbred strain 两 个近交系 ， 除 了在一 个指明位 点等 位基因 不同外 ，其 他 遗传基因 全部相 同， 简称同源突变 系。 一 般 由 近交系 发生基因 突变 或人工 诱变 （如 基因 剔除 ）形成 的。 4 遗传分类及命名原则 4.1 遗传分类 根据实验用鱼群 体内 个体间 遗传 差异 的不 同， 将其 区分为近交系 、封闭群和

7、杂交群。 4.2 命名原则 4.2.1 近交系 近交系 一般 以大 写英 文字母 命名 ， 亦可以 用大 写英文 字母加阿拉伯数字 命名 ， 符号 应尽 量简短 。 如 AB系 、 TU系 、 WIK11系等。近交 代数 用大 写英 文字母 F表示。 例如当一 个近交系的近交 代数 为87代时 ， 写成F87。如果 对以 前的 代数 不 清楚 ，仅 知道 近期 的近交代数 为25，可以 表示 为F?+25 。 4.2.2 封闭群 (远交系) 封闭群 由24 个 大 写英 文字母 命名 ，种 群名 称前标 明保持者 的英 文缩写 名称 ，第 一 个字母须 大写， 后面的 字母小写 ，一般 不超过

8、4 个字母 。保持 者与种群名称之间 用冒号 分开 。 4.2.3 杂交群 杂交群 应按 以下 方式 命名： 以 雌 性亲代 名称在 前， 雄性亲代名 称居 后， 二者 之间 以大 写英 文字母 “ X” 相 连 表示杂 交。 将以 上部分用括 号括 起， 再在 其后 标明杂 交的 代数 （如F 1 、 F 2 /等）。 例如：（ AB X WIK） F 1 ， 表示AB 系和WIK 系 杂 交的子一代 。 4.2.4 斑马鱼相关基因的命名 有 关斑马鱼相关基因的命名原则 ，参见 附录 A。 5 实验用鱼的繁殖方法 5.1 近交系的繁殖方法 5.1.1 原则 选择近交系实验用鱼繁殖方法的原则

9、是保持 近交系的 同 基因性及 其基因 纯合性。 5.1.2 引种 作为繁殖用原 种的近交系实验用鱼 必须 遗传 背景明确，来 源清楚 ，有 较完整 的资料（ 包括品 系名 称、 近交代数 、 遗传基因 特点 及主要生物学 特征 等）。引 种 的实验用鱼 应来 自近交系的基 础群 ， 数量不少于 10对。 5.1.3 近交系的繁殖 DB11/T 1053.32013 3 近交系的繁殖 可分为基 础群 、 血缘扩 大群和生 产群。 当 近交系实验用鱼生 产供 应 数量 不是 很大时， 可不设血缘扩 大群 ，仅 设置 基 础群和生 产群。 具体 要求同 GB 149232010的 4.1.4 4.

10、1.6。生 产 群 随机 交配应不 超过 4代 。 5.2 封闭群的繁殖方法 5.2.1 原则 选择封闭群实验用鱼繁殖方法的原则 是尽 量保持 封闭群实验用鱼的基因 异质性及多态 性， 避免近交 系 数 随繁殖 代数 增加而过 快上升 。 5.2.2 引种 作为繁殖用原 种的封闭群实验用鱼 必须 遗传 背景明确，来 源清楚 ，有 较完整 的资料（ 包括 种群名 称、 来 源 、遗传基因 特点 及主 要生物学 特性等）。 为保持 封闭群的遗传 异质性及基因 多态 性， 引种 实验用鱼的 数量要 足够多 ， 封闭群实验用鱼引种数 目 一般 不应少于 50对 。 5.2.3 封闭群的繁殖 为 保持

11、封闭群实验用鱼的遗传基因的稳 定， 封闭群 应大于100对， 采取 群体 循 环或随机 交配法 进行 繁殖， 具体 方法 可按照 GB 149232010 的附录B 。 5.3 杂交群的繁殖方法 将 适 龄的 雌性 亲代 品系 与另 一 个品 系的 雄性 亲代杂 交， 即 可得 到F1 实验用鱼。 雌雄亲 本交配 顺序不 同 ， 得到 的F1也 不一 样。 6 近交系实验用鱼的遗传质量监测 6.1 遗传质量要求 近交系鱼 应符 合以下 要求 ： a) 具有明确 的品 系背景 资料 ，包括品 系名 称、 近交 代数 、 遗传 组成 、主 要生物学 特 性等 ， 并能充 分 表 明新 培育 的或

12、引种 的近交系鱼 符合近交系的定义。 b) 用于近交系 保种 及生 产的繁殖系 谱及记录 卡应 清楚 、完整 、繁殖方法 科学。 c) 遗传检测 (生 化标记 、微卫星分子 标记 、SNP 分子 标记等) 质量合 格。 6.2 遗传检测及方法 6.2.1 微卫星分子标记检测 6.2.1.1 抽样 对基础 群，凡 在子代 留 有种 鱼的 双亲都 应进 行检测。 对 生产 群 ，按 表 1要 求从每 个近交系中 随机抽 取 成 鱼， 雌雄各半 。 DB11/T 1053.32013 4 表 1 抽检数量 生 产 群 中 种 鱼 数 量 抽样数目 100尾以下 6尾 100尾以上 5%，最大取样量为

13、30 尾 6.2.1.2 微卫星分子标记的选择 选择分 列于近交系斑马鱼 25对 染色 体、剑尾鱼 24对不同 染色 体上的 5个以 上位 点 ，作为遗传检测的 微卫星分 子标记。检测方法 见 附录 B。 6.2.1.3 结果判断 按 表 2要 求执 行。 表 2 结果判断 检测结果 判 断 处 理 与 标 准 遗传概貌完全一致 未 发 现 遗传 变异，遗传质量 合 格 有 一 个 位 点 的分子或生化标记 与 标 准 遗传概貌不一致 可疑 增 加 检测位点数 目 和 增加 检 测方法后重检，确 实 只 有 一 个标记 基因改变可命名为同源突变系 两 个 或 两 个 以 上 位 点 的标记基因

14、 与 标 准 遗传概貌不一致 不合格 淘汰，重新引种 6.2.2 SNP分子标记检测 6.2.2.1 抽样 按表1 要求 执行 。 6.2.2.2 SNP分子标记的选择 选择位于 近交系斑马鱼25 对染色 体、剑尾 鱼 24对 染色 体上 的10个 以上 位点， 作为遗传检测的 SNP标 记。检测方法 见附录 C。 6.2.2.3 结果判断 按 表 2要 求执 行。 6.2.3 生化标记检测法 6.2.3.1 抽样 按表1 要求 执行 。 6.2.3.2 生化标记的选择 DB11/T 1053.32013 5 选择位于 近交系斑马鱼25 对染色 体、剑尾 鱼 24对 染色 体上 的5个 以上位

15、 点， 作 为遗传检测的生 化标 记。 6.2.3.3 结果判断 按 表 2要 求执 行。 6.3 检测频率 每年至 少对 近交系鱼的生 产群进 行一 次遗传质量检测。 7 封闭群实验用鱼的遗传质量监测 7.1 遗传质量要求 封闭群实验用鱼 应符 合以下 要 求： a) 具有明确 的遗传 背景 资料 ，来 源清楚 ，有 完整 的资料（ 包括 种群名 称、来 源 、 遗传基因 特 点 及 主要生物学 特性等）； b) 用于保种 及生 产的繁殖系 谱及记录 卡应 清楚 完整 ； c) 封闭繁殖 ，保持 鱼的基因 异质性及 多态 性， 避免 近交系数 随繁殖 代数 增加而过 快 上升 ； d) 经遗

16、传检测 (微卫星分 子标记 、 SNP分子 标记 、生 化标记等 )证 明基因 频率稳 定 ，为相 同群 体 。 7.2 遗传检测及方法 7.2.1 抽样 随机抽取雌雄各 25尾以 上进 行 基因 型检测。 7.2.2 微卫星分子标记检测 按照6.2.1.2 方案 进行 。 7.2.3 SNP分子标记检测 按照6.2.2.2 方案 进行 。 7.2.4 生化标记检测 按照6.2.3.2 方案 进行 。 7.2.5 群 体评价 群 体内 遗传 变异 采用 平均 有效杂 合度 指标 或群 体平衡 状 态进 行度 量。 所用分 子 标记或 生化 标记 应 能 反映群 体基因 多态 性。 当 平均 有

17、效 杂合 度在 0.5 0.7时 ， 群 体为合 格的封闭群实验用鱼群 体。 或用群 体是否达 到平衡 状态 来判定 ， 如果 没有 达到 平衡 状 态， 说 明群 体的基因频率或 基因 型频率 发生 变化 ， 该 封闭群群 体判 为不合 格 。 7.3 检测频率 封闭群实验用鱼 每年 进行 一次遗传质量检测。 A DB11/T 1053.32013 6 附 录 A （资料 性附录） 斑马鱼相关基因的命名原则 A.1 斑马鱼基因的命名原则 A.1.1 斑马鱼基因的 全名 一般用 小写斜 体英文 字母表示，其对应 的基因 符号 至少包 含三个 字母，所命 名的字母 组 合不 能与 斑马鱼的已 有

18、基因 突变体 或基因名重 复，基因名前 不加 “ Z” 和 “ Zf”，字母 中 间一般 不加 标点符号 。 A.1.2 新 基因的命名 应该到 国际 斑马鱼 信息网 （ http:/zfin.org）网站 上注 册登 记。 A.1.3 斑马鱼的基因为 哺乳动 物的 同源 基因（ orthologue）时， 一般采 用哺乳动 物 中所用的命名 ，并 用小写 斜体字母表示 。 A.1.4 基因家 族的 不同成 员按照 发现时间 的先后 顺序 用数字加以 区别 。 例如 ， 基因名： engrailed 1a、 engrailed 2b，对应 的基因 符号 ： eng1a、 eng2b。按照哺乳动

19、 物同源 基因的命名原则 ，对于少数已经发 表 的斑马鱼基因 ，旧 名可以 附 在新 名后 的括 弧内 ，如 shha (syu)， bmp2b (swr)。 A.1.5 斑马鱼 中存 在的 重复 基因（ duplicated genes）， 在 人或小 鼠的 同源 基因名 称后 添 加 “ a” 或 “ b” 字母 标示 ， 如 hoxa13a、 hoxa13b。 如果 用 “ a” 或 “b ” 字母与 已经 存在的 哺乳动 物同源 基因 冲突时 ，则 采用 “1 ” 或 “2” 数字 标示 ，如 stat5.1、stat5.2。 A.1.6 当与哺乳动物 同源 性较高但又无 法确认 是否

20、 为同源 基因时 ，一般在该 哺乳动 物基因名 后加 “ l ike” 表示 。 A.1.7 对于斑马鱼测 序计 划中获 得的新 基因， 一般 用测序 研究单位 加 克隆 号和 数字表示， 如si:bz3c1 3.1、si:bz3c13.2、 si:bz3c13.3，其中 si表示 Sanger Institute。 A.1.8 转 录 变体 的命名采 用该 基因名加transcript variant （ 在 基因 符号 中缩写为 tv）和顺序 数字表 示，如 基因名： myosin VIa, transcript variant 1，对应 的基因 符号 ：myo6a_tv1。 A.2 斑马

21、鱼 蛋白 质的命名原则 斑马鱼的 蛋白 质符号表示 方法与 斑马鱼的基因 符号表示相 同， 但不 用斜 体而 用正体英 文字母表示， 并 且首 位字母 大写 ， 例如Ndrw、 Brs、 Eng1a、 Eng2b、 Ntl。 一 些斑马鱼基因 符号 和蛋白 质命名 不同 于人 和 小 鼠， 见表 A.1： 表 A.1 人 和 小鼠与 斑马鱼基因 符号和蛋白 质命名 物种 基因符号 蛋白质符号 斑马鱼 shha Shha 人 SHH SHH 小 鼠 Shh SHH 注 ： 在 文 献 中，有时将一个众所周 知的常用蛋白符号放入括弧内 ，附在根据同源基因命名的符号 后边。例如：Shha (Syu)

22、 、 Bmp2b (Swr)。 A.3 染色体 和畸 变 斑马鱼的 25对染色 体Chr1 Chr25 对应于以 前的 连锁群 LG1LG25 ， 但 染色 体发生 重 排时 通常使 用一 些前缀 表示 。 其中， Df表示缺失 （ deficiency） 、 Dp表示 重 复 （ duplication） 、 In表示倒 位 （ inversion） 、 Is表示 插入 （ insertion） 、 T表示 易位 （translocation ） 、 Tg表示 转基因（ transgene）。 在 描述缺失 型 时 ， 一般 用Df(Chr#)xxxallele 表示，染色体序号用两位数字表

23、示，如 Chr03表示三号染色体 ； xxxallele表示 由研究者 描述 的 缺陷 的主 要特征 及其 等位基因 ， 例如 Df(Chr12)dlx3b380。 在易 位类 型为DB11/T 1053.32013 7 相 互易位时，这时涉及到两 条 染色体，一般要对每 条染色体进行明确的描述 。通用表示形式为： T(Chr#;Chr#)xxxallele,#U.#L 和 T(Chr#;Chr#)xxxallele,#U.#L，其中T 表示易位 型， (Chr#;Chr#)表示 易位 涉 及到的 染色 体号 码， 染色 体序 号 用两 位数字表示，中 间 用分号区 分； xxxallele

24、表示由研究者 描述的易 位 的主要特征及 其等位基因； #U.#L表示染色 体 的 上臂 （ upper arm）和 下 臂 （ lower arm） ，中间 的句点表示 着丝粒 。 例如T(Chr02;Chr12)cycb213 ， 02U.12L02L 和 T(Chr02;Chr12)cycb213， 12U.12L02L。 等位基因和基因 型命名 在 斑马鱼 中，描述 等 位基因 野生型 用上标 “ + ” 表示， 等位基因 突变 型则采 用上 标的实验 室 分配 字 母 （ 例如 ： http:/zfin.org/zf_info/zfbook/lab_desig.html所示 ） 外加

25、数字表示， 例如 b代表 Eugene 实验室 、 m代表 MGH和Boston 实验 室 、 t代表 德国 的Tuebingen 实验 室 ； 如果 是显性等位 基因则 还在 实验 室 分配 字母 前加上 “ d” 。 例如 ：lof + 表示lof 基因的 野生型 等位 基因， lof dt2 则 表示lof 显 性等位 基因 Tuebingen实验 室突变 编号2 。 非 连 锁 基因 座 ：纯 合子 的不 同 基因 座依1 25 号染色 体顺序排 列，其 间用分 号隔 开 ， 如ednrb1 b140 ; slc24a5 b16 。 杂 合 子 需 用 “ /” 区 分 同源染色 体上

26、的等 位基因 ，如ednrb1 b140 /ednrb1 + ; slc24a5 b16 /slc24a5 m592 。 连锁基因 座： 每 个染色 体上 的 单元 型基因 座按 列出 ， 同一 染色 体上 的基因 座 间用空 格隔 开 ， 按基因 座在连 锁群 中的 位置 从上到 下 依次 排列； 同源 染色体 基因用 “ /” 分 开， 非同源 染色 体基因用分 号隔 开， 如 ： ednrb1 b140cx41.8 t1 ; slc24a5 b16 。 未 定 位 基因座的基因型按字母顺序排列在 “ ” 中，并附在已定位的不同染色体基因型之后。 如 ednrb1 b140 ; mycbp

27、2 tj236edit z253 （edi 表示 未定 位，三 个基因 座位于不 同的 染色 体 ）。 同一 染色 体上 分辨率 差的基因 座按 字母 顺序排 列在 “ ” 中 。 如 abcb 000def m000 （同一 染色 体上 分辨率 差的基因 座) ；ednrb1 b140abcb 000def m000 cx41.8 t1 （ 同一 染色 体上 位于 已 知基因 座之间 的分 辨率 差 的基因 座位 ）。 A.4 转基因 载体 和转 基因斑马鱼 品 系的命名 转 基因 载体一般表示 为Tg (promoter:gene) ，其中Tg 表示为 转基因 ，括 号中左边显示 调控序

28、列 如 启动子，右边表示编码基因 ，中间用 “ :” 分开。例如 Tg (SsNdr2:GFP)表示由 SsNdr2驱动 GFP基因表 达 的转基因 载。 此 外， 调 控序列可以由 增强 子和 启动 子组 成； 当编码 基因为 两个不 同 的基因 融合 而成时 则 用 “ -” 分 开 ， 例如Tg (-3.5hhex-ERE:sptb-GFP)。 但当转基因载体存在多个 表达框，并且每个表达框 都有自 己的 调控 序列 和编码 基因 时，可以 用 “ ,” 区 分，如 Tg (isl3-RARE:GAL4,UAS:GFP)。 转基因 品系 存在两种 情况 ，一种 是由 被转 入基因 产生等

29、位 基因 ，另 一种 不知道 是 否成 为等 位基因。 对于前者，用等位基因名 上标加转基因Tg上标，如arnt hi2639cTg ；对于后者 则用 转基因载体命名加上实验 室指定名和 独一 编号 ，如 Tg (hsp70l:GFP)mik6。 A.5 增强子 、启动 子、 基因 诱捕载体 和诱捕 斑马鱼 品系的命名 增 强 子 、启 动 子、 基因 诱 捕载体的命名与 转基因 构 载体的命名基本相 同 ，需要 将 相 应的 Tg改为 Pt （启动 子捕 获） ，G t （基因 捕 获） ，Et（ 增强 子捕 获）等。 A.6 核转移 系（ Conplastic strains）的命名 命名

30、方法为 NUCLEAR GENOME-mtCYTOPLASMIC GENOME，如AB-mtTU 指带有 AB系 核基因组 和TU系 细胞 质的品 系。这 样的品 系是以 雄 的 AB系斑马鱼与 雌的 TU系斑马鱼交配 ，子代 雌 鱼与 AB系雄 鱼 反复 回 交10 代而成 。 B DB11/T 1053.32013 8 附 录 B （资料 性附录） 斑马鱼微卫星遗传标记的检测方法 B.1 基因组 DNA的提取 剪 取 斑马鱼 TU或 AB等 品系的 尾 鳍， 参照标 准平衡 酚 氯仿 抽提 程序 提取 DNA。 具体方法 如下 ： a) 将尾鳍 置 1.5 mL的 Eppendorf管中，

31、 用消毒剪刀剪碎 ， 加入 50 L无 水乙醇 进行脱 水处 理 ， 并让无 水乙醇挥 发掉 ； b) 向管中 加入 适量的 细胞 裂解液 （800 L1 mL ） ， 终浓 度为 0.5%的 SDS，以 及 终浓 度为 100 g/mL 的 蛋白 酶 K，慢慢混匀 后于 55水 浴锅 或烘箱 中消化 3 h以上 ； c) 取出消 化后 的样 品， 将其 摇匀， 冷却 至室 温， 然后 向管中 加入与 细胞 裂解液 等体积 的平衡酚， 轻轻混匀 15 min，12000 rpm 4 离心 10 min，缓慢 抽取上清 液， 置于 一新的 Eppendorf管中 。 如此重 复再次 酚- 氯仿

32、抽提； d) 向抽提 吸出的 上层 清液 中加入等 体积 的氯仿 异戊醇 （24： 1） ，以 去 除 残 留 的 酚 ， 轻轻混匀 15 min，12000 rpm 4离心 10 min，吸 取上清 液于 一新 Eppendorf管 中； e) 加入 2.5倍体 积在-20 预冷的 无水 乙醇 ，于 -20 放 置 30 min，之后 12000 rpm 4离心 10 min，弃去管 内的 液体 ； f) 用 75%的乙醇洗涤 两次 ，每次都 要 12000 rpm 4离心 5 min，弃去液 体； g) 室温晾干， 使乙醇 全部 挥发 ， 然 后加入 适量的 TE（ PH=8.0） ，于

33、室 温 下 充 分 溶解 ， 冻 存 于-20 。 B.2 PCR扩增 根据设 计好 的目 标微卫星引物（ 参见 表 B.1） 进行 PCR扩增 。 PCR 反 应 体 系 如 下 ： 10 PCR buffer 2.5 L dNTP(2.5 mmol/L) 0.5 L 上 游 引物（ 5 pmol/L） 0.5 L 下 游 引物（ 5 pmol/L） 0.5 L Taq酶 （1 U/ L） 1 L DNA模板 （100 ng/ L） 1 L 灭菌双 蒸水 19.0 L 25 L PCR反 应程 序为:95 预 变 性5 min ， 94 变 性30 s ， 55 60 退火( 因引物 而异

34、) 40 s， 72 延伸40 s ，35 个循 环，最 后 于72 下 延伸10 min。 B.3 PCR产物 的电泳 因为要分 辩小至 几个 bp的 DNA片段，所以需 要利用分 辨率较 高的非变 性 聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行 产物检测 ，而 不能 用琼脂糖凝胶电泳 进行 检测。 a) 制胶： 10%的非变 性聚丙烯酰胺凝胶 ； b) 电泳： 每个 产物 上样 3 L， 同时点上 DNA分 子量标记 Marker， 用 1 TBE电泳缓 冲 液， 250 V 恒压电泳 ，2.5 h 。 B.4 PCR产物染色观察 DB11/T 1053.32013 9 染色： 在1 TBE电泳缓 冲液 中

35、加入 几滴 10 mg/mL溴化 乙啶染色 10 min左右 ，然 后用水 浸洗 5 min。 观察： 运用 Gene Genius凝胶 成 像系 统扫 描， 并拍 照， 保 存记录。 B.5 微卫星分 析所需试剂 的配 制 B.5.1 提取DNA 所用 试剂 的配 制 B.5.1.1 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 18.61 g EDTA二 钠盐 溶于 80 mL双 蒸 水中， 用NaOH 调 pH值至 8.0， 定容 至100 mL ， 高 压灭菌20 min 。 B.5.1.2 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 12.11 g Tris Base 溶 于80

36、mL 双 蒸 水中， 用 浓盐酸 调节pH 值至8.0 ， 定容 至 100 mL。 高 压灭菌20 min 。 B.5.1.3 细胞裂解液 1 mol/L Tris-HCl 1 mL 0.5 mol/L EDTA 20 mL 补 足双 蒸水 至 100 mL， 充 分 搅拌 ，高 压灭菌 20 min。 B.5.1.4 10SDS （十二烷 基硫酸钠） 称 取 10 g SDS慢慢 转移 到 盛有约 90 mL双 蒸 水 的 烧杯 中， 充分 搅拌直 至完 全溶解。用 水定 容至 100 mL， 用 几滴浓盐酸 调pH 至 7.2。 高压灭菌15 min 。 B.5.1.5 氯仿异戊醇 96

37、 mL氯仿和4 mL 异 戊醇混 合 ，棕 色瓶 保存 。 B.5.1.6 TE (pH8.0) 1 mol/L Tris-HCl 1 mL 0.5 mol/L EDTA 0.5 mL 补 足双 蒸水 至100 mL ， 充 分 搅拌 ，高 压灭菌 20 min。 B.5.1.7 70%乙醇 350 mL无 水 乙醇 ，加 双蒸 水定容 至500 mL 。 B.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 及EB 染色所需溶液 的配 制 B.5.2.1 5 TBE Tris 54.0 g 硼酸 29.0 g 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 20 mL 溶解于 800 mL双 蒸 水，充 分搅拌 后

38、， 补足双 蒸水 至1000 mL 。 B.5.2.2 30%丙烯酰胺单体贮液 丙烯酰胺 29.0 g DB11/T 1053.32013 10 甲叉双 丙烯 酞铵 1.0 g 加 水 定容 至100 mL ， 过 滤 。 低 温 贮 存 ， 配 一 次 最 多 用 一 个 月 。 B.5.2.3 10%过硫酸铵 称 取 0.1 g过 硫酸铵 ，加 1.0 mL双 蒸 水 溶解， 用时 新鲜 配制。 B.5.2.4 10 mg/mL溴化乙啶 将 100 mg的 溴 化 乙 啶 溶 于 10 mL双 蒸 水中。 B.5.2.5 加样缓冲液（ 6 ） 0.125 g溴酚 蓝， 15 mL甘油，去离

39、 子水 加至 50 mL。 B.6 实验用斑马鱼微卫星分子标记的遗传 特征 常用实验用斑马鱼微卫星分 子 标记的遗传 特征见 表B.1。 表B.1 常 用实验用斑马鱼微卫星分子标记的遗传 特征 引物名 位点 引物序列（5 -3 ） 品系片段长度（bp） AB TU LF WIK 本 地 短 尾 Z24 LG15 CACCTTCACGGTGAGTAGCA GTGGAATGGTGTGACTAATGTCA 150 150 150 Z928 LG18 CAGTCCAGGCTGAACATTCA ACACCTTCGGCAGTTTTCAC 134 94 134 126 Z1059 LG7 AACAGGTGA

40、CAGAGCACACG GGGAGAGGGCAGGACAATAT 150/122 150/122 Z1265 LG6 ATATGTGCTGCTCATGATGAGT AACAGACGAAGGGTGAAGGA 90110bp 90110bp Z1637 LG8 GGCTTTTGGATGAAGGTTGAGC GGAATCACAATGGCAGCAGA 143 105 133 103 Z3725 LG3 ACTAAATCGCACTTCAGCAGCG GGTGTCCTCACATCAGCTGCA 262 256 248 248 Z3782 LG19 AATTCTGGGGGGTAATTCTGGC AAGGGG

41、GCTAAACCTTCAACTG 200 90 170 120 90 Z4299 LG5 AGGAATGCGCTATGGGACGA CACATCTGCCACTGAACCGG 370 260 230 260 230 280 260 300 260 190 Z5223 LG15 AACAGAGCCGATCTGCCACC AGCACAGCGGAGGAAATAAAGC 178 150 178 150 DB11/T 1053.32013 11 表 B.1 常用实验用斑马鱼微卫星分子标记的遗传 特征 (续 ) 引物名 位点 引物序列（5 -3 ） 品系片段长度（bp） AB TU LF WIK 本 地 短

42、 尾 Z9384 LG19 CCGACTGGAGAAGACCTGAG AGCATAATCAGACAACCGGG 134 177， 190 134， 177， 190 134 177， 190 134， 177， 190 134 177， 190 134， 177， 190 Z24244 LG12 TGGTCACTGAGGGTCTGATG CAGGGCTGCATTACTGTGATT 180 170 180 160 160 210 190 170 Z10508 LG21 AGCAGATCACAGGCCTTTCC AGATCTCCTGCTGCCAGTGT 98 105 98， 119 98 105

43、98， 119 98 105 98， 119 Z20046 LG20 TTCAGGTTTAAGGTTATAAAAACGA AACCAATATGTCATGGCATCC 184 270 302 184， 270 184， 302 184 270 302 184， 270 184， 302 184 270 302 184， 270 184， 302 C DB11/T 1053.32013 12 附 录 C （资料 性附录） 斑马鱼 SNP遗传标记的检测方法 C.1 基因组 DNA的提取 参见附录B.1中 的方法 进行。 C.2 PCR扩增 采 用Touchdown PCR 热 循 环 程 序 ， 具

44、 体 方法 如下 ： 92 C 60s， 一 个循 环； 92 C 20s， 65 C 20s, 72 C 30s， 扩增 30个循 环，其中每 个 循环 退火温 度降 0.4 C ； 92 C 20s, 58 C 20s,72 C 18s， 扩增 10个循 环。 反应体 系如 下： DNA模板 （ 30 ng50 ng） , 正反 向引物（ 0.2 M ） ， dNTP（ 400 M ） , Tricine （ 25 mM ） , 7.0% 甘油 (w/v), 1.6% DMSO (w/v), MgCl2（ 2 mM） , 醋酸铵 (85 mM ， pH 8.7), Taq 聚 合酶（ 0.

45、2 U） ，总 体 积为10 L。 C.3 SNP标记的检测 将热循 环之后的PCR 产 物用 25 L的水稀释，并 用枪头吹打 混匀。然后取 1 l 为 模板 ，用表C.1 中 的 引物进 行 PCR扩增 和双 脱氧 循 环测 序，最 后可 使用 PolyPhred 等程 序软 件分 析SNP 标记的测定 结果 。 C.4 SNP分子标记的 特征 SNP分 子标记的名 称及 常用近交系斑马鱼的 SNP分子 标记的特征见 表C.1 。 表 C.1 常 用实验用斑马鱼 品系 SNP分子标记的 特征 染色体：位点 SNP ID AB TU 引物（5 -3） dbSNP ID 01:01859552

46、9 DS043503-5 T C GGCGATTCCTACAATTCTTC GAAAGTCCTGTGTTGAAGGTG ss49838906 01:049159399 DS036502-3 G C GGCACATCGTCATATAATGC ACAATACTGGAATGACACTGG ss49838640 02:025012321 DS042554 A G GAAGTCCATGTTGGCATCTAC AGTGTTGAGAAACGGTCAGG ss49824928 02:027720831 DS040180-3 T G AACACTGGCACGTACACAAG GGGAATCGTGAACTCGTA

47、AC ss49838788 03:048073042 DS032197-8 A T TCATTGTAATAGCAGTAATGACG TGCAATGTTTGTTTCAGACC ss49838454 DB11/T 1053.32013 13 表 C.1 常用实验用斑马鱼品 系 SNP分子标记的 特征（续） 染色体：位点 SNP ID AB TU 引物（5 -3） dbSNP ID 03:048073049 DS032197-7 G A TCATTGTAATAGCAGTAATGACG TGCAATGTTTGTTTCAGACC ss49838453 04:003254191 DS036864-20 T

48、 G CTGCTGTTACTGGGTCAGTG ACTGCATGATAATGCCAAAC ss49838683 04:003254203 DS036864-19 G A CTGCTGTTACTGGGTCAGTG ACTGCATGATAATGCCAAAC ss49838682 05:015736030 DS002778-2 T C AAACGTGGCAGAAATGAAAC CCCATTTGTAGAAGAATCCAG ss49837738 05:025044903 DS009184-1 T C TTGCATTAGAGCCTTATCCTG TGTTCTTATGCTCTGTGACTG ss498378

49、39 06:001111132 DS014169-1 T G GAGCAGCGATACTCACACAG TTCACTAGGTAAGACTCTTGAAGC ss49837929 06:024875905 DS032220-5 C T TCTCTTTAATGTTGGACTGCTG CCTTTAATCCATAGCCTTAGC ss49838470 07:018909158 DS033959 C T GACACATACCTGGCACTCG TCTCCTGAGAAGGATTCCAC ss49816684 07:019711091 DS023709 C T CAGTTGAGAAGGGAGAAACG GCTGTTGGGTTGACTTGC ss49806847 08:010818674 DS023589-1 G A AGGAAAGACACCATCACTGAG CTTTAGGCGCAATAACAAGG ss49838126