DB37 T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术.pdf

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1、 ICS 67.050 CCS X 04 37 山东省 地方标准 DB 37/T 4415 2021 -乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中 -乳球蛋白的检测技术 Detection of -lactoglobulin gene knockout cow and -lactoglobulin in cows milk 2021 - 10 - 18 发布 2021 - 11 - 18 实施 山东 省 市场监督管理局 发 布 DB 37/T 4415 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内

2、容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东奥克斯畜牧种业有限公司、 蒙天乳业有限公司、山东省畜牧总站。 本文件主要起草人：黄金明、戴蕴平、魏晓超、丁芳荣、王秀革、鞠志花、姜强、胡智胜、张亚冉、 高亚平、刘文浩、王金鹏、杨春红、李彦芹、宋明智、高运东、侯明海。 DB 37/T 4415 2021 1 -乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中 -乳球蛋白的检测技术 1 范围 本文件确立了 -乳球蛋白（ BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反

3、应（ PCR）鉴定方法，以及牛 奶中 -乳球蛋白（ BLG）的定性免疫印迹（ Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ ELISA）检测方法。 本文件适用于 -乳球蛋白（ BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中 -乳球蛋白的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生

4、物学检测 GB/T 27642 2011 牛个体及亲子鉴定微卫星 DNA法 NY/T 1663 2008 乳与乳制品中 -乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 NY/T 1672 2008 绵羊多胎主效基因 FecB分子检测技术规程 NY/T 2695 2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 SN/T 2497.16 2010 进出口危险化学品安全试验方法 第 16部 分： Western-Blot实验 农业部 2031号公告 -14-2013 转基因动物及其产品成分检测 普通牛 (Bos taurus) 内标准基因 定性 PCR方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛 -

5、乳球蛋白基因 Bos taurus -lactoglobulin BLG BLG基因（ NCBI Reference sequence: NC_037338.1），简称 PAEP，来源于普通牛（ Bos taurus）， 编码 -乳球蛋白的基因。 注： 基因全长 4 900 bp，由 7个外显子和 6个内含子组成， 编码 252个氨基酸。 3.2 -乳球蛋白基因敲除奶牛 -lactoglobulin knockout cow 利用基因编辑技术敲除 -乳球蛋白基因的奶牛。 4 聚合酶链式反应（ PCR）法 -基因定性检测 原理 4.1 通过设计特异引物，扩增出包含牛 BLG基因全长的 DNA片段

6、，对扩增产物进行测序分析。依据 BLG基 因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除 BLG基因。 DB 37/T 4415 2021 2 试剂或材料 4.2 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.2.1 水： GB/T 6682，三级。 4.2.2 50 TAE缓冲液：称取 Tris-base 242.2 g，加入冰乙酸 57.1 mL， 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)100 mL， 用水定容至 1 000 mL。使用时，用水稀释为 1 TAE。 4.2.3 1 %琼脂糖凝胶： 1 g琼脂糖充分溶解于 1 TAE，定容至 100 mL。 4.

7、2.4 BLG基因引物： 上游引物： 5 -GCCTCTCGCATCTGACACTT-3； 下游引物： 5 -AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3； 预测野生型扩增片段大小为 6 728 bp。 4.2.5 内标准基因引物：参照农业部 2031号公告 -14-2013。 4.2.6 引物溶液：引物用水稀释到 10 mol/L。 仪器设备 4.3 4.3.1 PCR扩增仪：温度范围 4 99 ，温度梯度范围 20 ，模块单元 96 0.2 mL。 4.3.2 离心机：最高转速 12 000 r/min，最大容量 24 2 mL。 4.3.3 电子天平：量程 0.001 g 10

8、0 g，感量 0.001 g。 4.3.4 凝胶成像分析系统。 4.3.5 稳压稳流电泳仪：输出电压 0 V 600 V，输出电流 0 mA 100 mA。 4.3.6 高压灭菌锅：使用温度范围 45 135 ，最高使用压力 0.255 Mpa。 4.3.7 微波炉。 样品 4.4 4.4.1 采集静脉血样 3 mL 5 mL，医用抗 凝管或 ACD抗凝， -20 以下保存。 4.4.2 采集组织（耳组织等） 0.1 g 0.3 g，浸入 75%的酒精， -20 以下保存。 4.4.3 采集带毛囊的牛毛 20 30根，浸入 75 %的酒精或置于毛囊卡， -20 以下保存。 4.4.4 采集 0

9、.2 mL 0.5 mL鲜精或 1 2支细管冷冻精液，备用。 试验步骤 4.5 4.5.1 DNA 提取 基因组 DNA提取按照 GB/T 27642 2011附录 B规定执行。 4.5.2 DNA 浓度和纯度检测 DNA浓度和纯度检测按照 NY/T 1672 2008中 7.3的规定执行。 4.5.3 PCR 扩增 4.5.3.1 样品 PCR 扩增 4.5.3.1.1 内标准基因 PCR 扩增 反应体系及反应程序按照农业部 2031号公告 -14-2013。 4.5.3.1.2 基因特异性序列 PCR 扩增 DB 37/T 4415 2021 3 4.5.3.1.2.1 PCR扩增体系。

10、Taq DNA聚合酶 0.5 L； 2 PCR buffer 25 L； dNTP Mixture (2.5 mM) 8 L；上下游引物 (10 M) 各 1.0 L；模板 DNA 200 ng 1 g；加双蒸水至总体积 50 L。 4.5.3.1.2.2 PCR扩增程序。 94 1 min； 94 30 s， 52 30 s， 72 6 min， 35个循环； 72 10 min， 4 保存。 4.5.3.2 对照 PCR 扩增 以 野生型奶牛基因组 DNA（序列信息见附录 A）作为阴性对照；以含有 16 bp缺失的 BLG基因敲除奶牛 基因组 DNA（序列信息见附录 B）作为阳性对照；以水

11、作为空白对照。 除 DNA模板外，对照 PCR扩增条件与 4.5.3.1.2相同。 4.5.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 按照 NY/T 2695 2015中 6.4.2的规定执行。 4.5.5 测序分析 将检测合格的 PCR产物进行全长测序分析。 结果判定与表述 4.6 4.6.1 对照检测结果分析 在内标基因、阳性对照和阴性对照 PCR扩增中，内标基因和 BLG基因特异性序列均扩增出与预期大小 一致的产物，空白对照无 预期扩增片段，则表明 PCR反应体系正常；否则，需重新扩增。 4.6.2 样品检测结果判定和表述 PCR扩增的 -乳球蛋白基因片段参考序列（野生型）见附录 A。对测序结

12、果和参考序列进行比对， 判定样品是否发生基因敲除。 4.6.2.1 如果样品序列与参考序列一致，未造成蛋白质编码异常，表述为“ BLG基因未敲除奶牛”。 4.6.2.2 如果样品序列与参考序列比对，出现突变，且提前引入了终止密码子，造成蛋白质编码异常， 表述为“ BLG基因敲除奶牛”。 5 免疫印迹（ Western-Blot）法 -蛋白定性检测 原理 5.1 对预处理的牛奶样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用牛 -乳球蛋白特异性第一抗体和辣根过氧 化物酶标记的第二抗体进行检测，根据条带位置和着色深度判定样品中是否含有 -乳球蛋白。 试剂或材料 5.2 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.2.

13、1 水： GB/T 6682，三级。 5.2.2 牛 -乳球蛋白标准品储液（ 10 mg/mL）：称取 0.1 g 牛 -乳球蛋白，溶解于 10 mL 双蒸水中， 分装， -20 以下保存。 5.2.3 10 % SDS：将 10 g的 SDS粉末溶于 80 mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL。 5.2.4 30 %丙烯酰胺：将 29 g丙烯酰 胺和 1 g N,N -亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60 mL的蒸馏水中， 充分溶解后，定容至 100 mL。 DB 37/T 4415 2021 4 5.2.5 1.5 M Tris-HCl(pH8.8)：将 181.65 g Tris

14、溶于 800 mL 蒸馏水中，加浓盐酸调 pH 至 8.8，定 容至 1 000 mL。 5.2.6 1 M Tris-HCl(pH=6.8)：将 121.1 g Tris 溶于 800 mL 蒸馏水中，加浓盐酸调 pH 至 6.8，定容 至 1 000 mL。 5.2.7 10 %过硫酸铵：将 10 g过硫酸铵粉末溶于 80 mL 蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL。 5.2.8 15 % SDS-PAGE 分离胶（ 5 mL）： 1.1 mL 蒸馏水， 2.5 mL 30 %丙烯酰胺溶液， 1.3 mL 1.5 M Tris-HCl(pH8.8)， 0.05 mL 10 %SDS，

15、 0.05 mL 10 %过硫酸铵， 0.002 mL TEMED。 5.2.9 5 % SDS-PAGE 浓缩胶（ 2 mL）： 1.4 mL 蒸馏水， 0.33 mL 30 %丙烯酰胺溶液， 0.25 mL 1.0 M Tris-HCl(pH6.8)， 0.02 mL 10 %SDS， 0.02 mL 10 %过硫酸铵， 0.002 mL TEMED。 5.2.10 10转膜液（ 500 mL）： 15.1 g Tris， 75 g甘氨酸溶于蒸馏水中至终体积为 500 mL。 5.2.11 10 TBS（ 1 L）： 88 g氯化钠， 12.1 g Tris 溶于蒸馏水中至终体积为 1 L

16、，浓盐酸调整 pH至 7.6。 5.2.12 1 TBST（ 1 L）： 100 mL 10 TBS缓冲液， 899 mL 双蒸水， 1 mL 吐温 20。 5.2.13 BCA蛋白浓度测定试剂盒。 5.2.14 ECL化学发光显色液。 仪器设备 5.3 5.3.1 离心机：最高转速 12 000 r/min，最大容量 24 2 mL。 5.3.2 电子天平：量程 0.001 g 100 g，感量 0.001 g。 5.3.3 高压灭菌锅：使用温度范围 45 135 ，最高使用压力 0.255 Mpa。 5.3.4 金属水浴锅：控温范围 -10 100 。 5.3.5 稳压稳流电泳仪：输出电压

17、 0 V 600 V，输出电流 0 mA 100 mA。 5.3.6 半干转膜仪。 5.3.7 化学发光成像系统。 样品 5.4 5.4.1 液态样品 取液态样品 50 mL，离心 12 000 g， 5 min，去除脂肪层，取上清液，待测或 -80 以下保存。 5.4.2 固态样品 称取固态样品 5 g，加适量水溶解，定容至 50 mL，制成液态样品，随后按照 5.4.1操作。 试验步骤 5.5 5.5.1 样品蛋白浓度测定 使用 BCA试剂盒测定样品中的蛋白浓度。 5.5.2 样品制备 分别取总蛋白含量为 30 g的待检样品、阴性对照样品（不含 -乳球蛋白的牛奶），以及 1 g -乳球蛋白

18、标准品，加入 5 SDS-PAGE加样缓冲液， 100 水浴 10 min。 5.5.3 十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE） 采用 NY/T 1663 2008中的方法进行 SDS-PAGE凝胶电泳。 DB 37/T 4415 2021 5 5.5.4 转膜 按照 SN/T 2497.16 2010中转膜方法执行。 5.5.5 封闭 将 PVDF膜置于封闭液中，室温水平摇动 2 h或 4 过夜。 5.5.6 第一抗体结合 在自封袋中 加入适当比例稀释的兔抗牛 -乳球蛋白一抗抗体，放入 PVDF膜，排净气泡后封口，室 温水平摇动 2 h。 5.5.7 洗膜 用 TBST溶

19、液洗膜， 10 min/次， 3 5次。 5.5.8 第二抗体结合 在自封袋中加入适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗抗体，放入 PVDF膜，排净气泡后 封口，室温水平摇动 1 h。 5.5.9 洗膜 用 TBST溶液洗膜， 10 min/次， 3 5次。 5.5.10 显影 将 ECL显色液试剂 A、 B液等体积混合，加入到膜表面， 1 min 2 min，置于化学发光成像系统中拍照 保存结果。 结果判定与表述 5.6 5.6.1 对照检测结果分析 -乳球蛋白标准品检测到预期大小（ 18 kD）的条带，空白和阴性对照无特异性条带，则表明 Western-Blot检测方法正常；否则，需

20、重新检测。 5.6.2 样品检测结果判定与表述 将样品进行 SDS-PAGE分离，使用牛 -乳球蛋白特异性抗体进行 Western-Blot鉴定，若在 18 kD分子 量处出现和 -乳球蛋白标准品泳道中大小一致的条带，判定该样品含 -乳球蛋白，表述为“ -乳球 蛋白阳性”；若在 18 kD分子量处无条带，判定为不含 -乳球蛋白的样品，表述为“ -乳球蛋白阴性”。 6 酶联免疫吸附（ ELISA）法 -蛋白定量检测 原理 6.1 在微孔板上预包被牛 -乳球蛋白抗体，样品中的 -乳球蛋白与生物素标记的 -乳球蛋白竞争性 地和微孔中的抗体结合，然后加入亲和素 -辣根过氧化物酶偶联物，加入显色底物，终

21、止液终止反应， 在酶标仪上读取 450 nm波长下的吸光度值，吸光度值与 -乳球蛋白的含量成负相关，与标准曲线比较， 再乘以稀释倍数即可得出样品中 -乳球蛋白的含量。 DB 37/T 4415 2021 6 试剂或材料 6.2 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 6.2.1 水： GB/T 6682，三级。 6.2.2 预包被 96微孔板：已包被人乳铁蛋白多克隆抗体的 96孔板（ 8孔 12条）。 6.2.3 100生物素偶联物：生物素标记的牛 -乳球蛋白偶联物，使用前用稀释缓冲液稀释 100倍。 6.2.4 100亲和素 -辣根过氧化物酶偶联物：使用前用稀释缓冲液稀释 100倍。 6.2.5

22、1 PBS缓冲液：将 1.44 g磷酸氢二钠， 0.24 g磷酸二氢钾， 8 g氯化钠和 0.2 g氯化钾溶于 800 mL 蒸馏水中，浓盐酸调整 pH 至 7.4，加水定容至 1 L。 6.2.6 稀释缓冲液：含有 1 % BSA的 PBS缓冲液：将 1 g BSA溶于 100 mL PBS缓冲液中。 6.2.7 洗涤缓冲液：含有 0.05 %吐温 20的 PBS缓冲液：将 50 L吐 温 20溶于 100 mL PBS缓冲液中， 震荡混匀。 6.2.8 四甲基联苯胺（ TMB）显色底物。 6.2.9 2 M硫酸反应终止液： 10 mL 98 %浓硫酸加入 60 mL蒸馏水中，定容至 100

23、 mL。 6.2.10 -乳球蛋白标准品溶液：用样品稀释缓冲液按照 10 g/mL， 5 g/mL， 2.5 g/mL， 1.25 g/mL， 0.625 g/mL， 0.313 g/mL， 0.156 g/mL浓度梯度制备 -乳球蛋白标准品溶液，样品稀释缓 冲液作为空白对照（ 0 g/mL）。 仪器设备 6.3 6.3.1 离心机：最高转速 12 000 r/min，最大容 量 24 2 mL。 6.3.2 电子天平：量程 0.001 g 100 g，感量 0.001 g。 6.3.3 高压灭菌锅：使用温度范围 45 135 ，最高使用压力 0.255 Mpa。 6.3.4 恒温箱：温控范围

24、为室温 +5 80 。 6.3.5 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 样品 6.4 按照 5.4.1和 5.4.2对样品进行脱脂处理，用稀释缓冲液将样品稀释 1 000倍（预测样品中 -乳球蛋 白含量优化稀释比例）。 试验步骤 6.5 6.5.1 准备实验所需试剂，并平衡至室温（ 20 25 ）。 6.5.2 取合适数量（按照每个样品和标准品溶液做两个平行实验）的微孔板放入板架上，每孔加入 50 L 标准品溶液或样品。 6.5.3 每孔加入 50 L生物素偶联物，密封， 37 孵育 30 min。 6.5.4 吸净孔中液体，每孔加入洗涤缓冲液 200 L，浸泡 2 min，吸净孔中液体，重

25、复 2 次，最后用 吸水纸拍干。 6.5.5 每孔加入 100 L亲和素 -辣根过氧化物酶偶联物，密封， 37 孵育 30 min。 6.5.6 按照 6.5.4步骤洗板 5次。 6.5.7 每孔加入 90 LTMB显色底物，避光， 37 孵育 20 min。 6.5.8 每孔加入 50 L终止液，溶液颜色由蓝色变为黄 色。酶标仪 450 nm 波长下读取吸光度值。 结果计算 6.6 6.6.1 计算样品溶液和标准品溶液的平均吸光度值。 6.6.2 以标准品的浓度为 X-轴，对应的平均吸光度值为 Y-轴，绘制标准曲线。 DB 37/T 4415 2021 7 6.6.3 标准曲线上样品吸光度值

26、对应的 -乳球蛋白浓度，乘以样品稀释倍数，即为所测样品中 -乳 球蛋白含量。若检测的 -乳球蛋白浓度高于标准品最高浓度，对样品进行合适倍数稀释后再检测。计 算公式如下： X = CN 式中： X 样品中 -乳球蛋白含量，单位为 g/mL； C 样品吸光度值对应的 -乳球蛋白浓度，单位为 g/mL； N 样品稀释倍数，本文件中使用的稀释倍数为 1 000。 检出灵敏度 6.7 本文件 ELISA方法的检出灵敏度为 0.13 g/mL。 7 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T 27403和 GB/T 19495.2规定执行。 8 废弃物的处理 按照 GB/T 19495.2规定执行。 D

27、B 37/T 4415 2021 8 A A 附录 A （资料性） PCR 扩增的野生型牛 -乳球蛋白基因序列 gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcc cctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctc cgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccag

28、tctctgcctccgtgttcactggcat tctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagct cacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccat cacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgtt gcaa

29、gaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggg gcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaa gccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctaggggg ggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatc

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32、actgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacac acctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccag agcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGA AGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAA

33、CCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGC CCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCG TGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAA GGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGG

34、AGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGG AGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTG CATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTC CCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACC TTTGTC

35、ATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGC TCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCT TTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACA GAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCC

36、CCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCT TGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGA GGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCC CGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCC

37、TGGAGGTCCACCCAAGGCTG CTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACAT CATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATT CGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATG AACAAGATG

38、TCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCA GTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAA CCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCAC CCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGC

39、CAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAG DB 37/T 4415 2021 9 CCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCTTTC AGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGG TCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGG

40、GCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTG ATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTG GGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTC CCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACG

41、GCTCCTTCA TCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTT CCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTG ACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGAC ACTGCAGGGCAGCTGGGGCC

42、ACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAG TCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCC TGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCA GAGTGAGGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGG

43、GGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGC TCCCCACCCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCAGAAACCCCCCTCCTG CTGGAACTCACTTTCCTCCCGTCTTGATCTCTTCCAGCCTTGAATGAGAACAAAGTCCTTGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACC TGCTCTTCTGCATGGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGCCTGCCAGTGCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGC

44、CCAGGGA GACCAGCTGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGGGAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGGGT CCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGAGCCGGTGTCCTGGGGGCCTGTGGGTGACTGGGGACGGGGGCCAGACACAC AGGCTGGGAGACGGGGGGCTGCAGCGCTCTGGTGTGACCATCACGATGGAGCCGGCGGTCACTATGAATCTAACAGCCTTTGTTACCGG GGAGTTTCAATTATTTCATCAA

45、ATAAGAACTCAGGCACAAAGCTGTCTTTCAACTGTCACGTCCTGAAAACAAATGGCAGGTGACATTT TCCATGCCATAGCAGTGCCACTGGGCATTTTCAGGGCCCATGTGCCAGGAGGGCGTGGGCATCGGCGAGTGGAGGCTCCTGGCCGTGTC AGCTGGCCCAGGGGGAGGAGGGGACCCAGACAGCCAGAGGTGGGGAGCAGGCTTTCCCCCTGTGACGCTGCAGACCCACCGCACTGCCC TGGGAGGAAGGGGAGGGAACTGGGCCAAGGGGGAAGGGCAGGTGTGCTGGAG

46、GCCAAGGCAGACCTGCACACCACCCTGGAGAGCAGGG GTTGACCCCGTCCCGGCCCCACAGTCAGGACCCCGGAGGTGGACGACGAGGCCCTGGAGAAATTCGACAAAGCCCTCAAGGCCCTGCC CATGCACATCCGGCTGTCCTTCAACCCAACCCAGCTGGAGGGTGAGCACCCAGGCCCCACCCTGCTCCTGGGGCAGGAAGCCACCCGG CCCAGGACCACCTCCTCCCATGGTGACCCCCAGCTCCCCAGGCCTCCCGGGAGGATGGAGACGGGGTGCAGGGCCCCGAGGTGG

47、CCCCC TCCCCACCCCCTCCCCAGCTCCCTCTGTCCTGGGGTGTCCAGTCCCATCCTGACGCTCCCCCGCCACGGCTCTCCCTCCCCCACAGAGC AGTGCCACATCTAGGTGAGCCCCTGCCGGCGCCTCTGGGGTAAGCTGCCTGCCCTGCCCCACGTCCTGGGCACACACATGGGGTAGGG GTTCTTGGTTGGGCCCGGGAGCCCCCATTAGGCCCTGGGGTCCCCCGTAGGAATGGCTGGAAGCTGGGGTCCTTCCTGGAGACTACAGA GCCGGCTGGCCACATGCTCGCTCTT

48、GTGGGGTGACCTGTGTCCTGGCCTCACTCACACGCTGATCTCCTCCACCTCCTTCCTGGCAGAC CTAAGGGCCAAGGTGGAGGGCTCAGGAAGTGACACCTAAGGGGGAGGCTAGGGGGGTCCTTCTCCCAAAGGAGGGGCCGTCCTGAATCC CCAGCCACGGACAGGCTGGCAAGGGTCTGGCAGGTACCCCAGGAATCACAGGGGAGCCCCATGTCCATTTCAGAGCCCGGGAGCCTTGG CCCCTCTGGGGACAGACGATGTCATCCCCGCCTGCCCCATCAGGGGACCAGGAGG

49、AACCGGGACCACATTCACCCCTCCTGGGACCCAG GCCCCTCCAGGCCCCTCCTGGGGCCTCCTGCTTGGGGCCGCTCCTCCTTCAGCAATAAAGGCATAAACCTGTGCTCTCccttctgagtc tttcctggatgatgggccgggggtggagaaggcccgggacagggtggggagtggtctggctcagaggatgatggtagggctgggatcca gggcgtctgcattacagtcttgtgacatctgggggcccacacacatctacggctctttgaaact 注： 下划线部分为引物序列位置；大写字母部分为 -乳球蛋白基因序列；大写加粗斜体 ATG为起始密码子， TAG为 终止密码子；大写加粗字体为编码序列。