DB41 T 1210-2016 农作物种子转基因成分检测方法.pdf
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1、ICS 65.020.01 B 05 DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB41/T 1210 2016 农作物种子转基因成分 检测方法 2016- 03 - 18 发布 2016- 06 - 18 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 12102016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准 由河南省 农业厅 提出。 本标准 起草单位:河南省种子管理站。 本标准 主要起草人: 陈晓、戴钢 、 周新保、邓士政、徐立新、滕开琼、霍焕霞 。 本标准 参与起草人: 褚凰羽、张英华、张文玲、赵燕、宋 新莉、肖琳琳、刘桂珍、闫瑾、韩赞平、吴刘记、常萍、刘
2、景堂、杨晓明、李东升、王春源、 程静、 董根忠、 郭瑞、 郭敬东、李欣、魏艳敏 、 赵侠科 。 DB41/T 12102016 1 农作物种子转基因成分检测方法 1 范围 本标准规定了农作物种子转基因成分检测的术语和定义、检测程序、实验室要求及污染防范、 检测要求 、仪器和设备、样品预处理、 核酸提取 与纯化、定性 PCR 反应及检测 、结果判定及 检测报告 。 本标准适用于农作物种子转基因成分检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 354
3、3.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.4 转基因产品检测 核酸定性 PCR检测方法 农业部869 号公告 -3 转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米 Bt11及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告- 4 转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜 MS1、 RF1及其衍生品种定性 PCR方法 农业部869号公告- 5 转基因植物及其产品成分检测抗除 草剂油菜 MS8、 RF3及其衍生品种定性 PCR方法 农业部869号公告- 6 转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜 MS1、 RF2及其衍生品种定性 PC
4、R方法 农业部869号公告- 7 转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米 TC1507及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告- 8 转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米 Bt176及其衍生品种定性PCR方法 农业部 869号公告-9 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 MON810及其衍生品种定性 PCR方法 农业部 869号公告-10 转基因植物 及其产品成分检测抗虫玉米 MON863及其衍生品种定性 PCR方法 农业部 869号公告-11 转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜 GT73及其衍生品种定性 PCR方法 农业部 869号公 告-12 转基因植物及其产品成分
5、检测耐除草剂玉米 GA21及其 衍生品种定性 PCR方法 农业部 869号公告 -13 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米 NK603及其衍生品种定性 PCR方法 农业部 953号公告-1 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 Bt10 及其衍生品种定性 PCR 方法 农业部 953号公告-2 转基因植物 及其产品环境安全检测 抗病水稻 第 2部分 :生存竞争能力 农业部 953号公告-3 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂油菜 T45及其衍生品种定性 PCR方法 农业部 953号公告- 4 转基因植物及其产品成分检测 抗除草剂油 菜 Oxy-235 及其衍生品种定性 PCR 方法 农业部
6、1193号公告- 2 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂油菜 Topas 19/2及其衍生品种定性PCR方法 农业部 1193号公告- 3 转基因植物及其产品成分检测 抗虫水稻 TT51-1及其衍生品种定性 PCR方法 DB41/T 12102016 2 农业部1485号公 告 -1 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花 MON1445及其衍生品种定性 PCR方法 农业部 1485号公告- 5 转基因植物及其产品成分检测 抗病水稻 M12及其衍生品种定性 PCR方法 农业部 1485号公告- 6 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆MON89788 及其衍生品种定性PCR方法 农业部
7、1485 号公告- 7 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆A2704 -12及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告- 8 转基因植物及其产品成分检测耐 除草剂大豆 A5547-127及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485 号公告 -9 转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米 59122及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485 号公告 -10 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花LLcotton25 及其衍生品种定性 PCR方法 农业部1485号公告- 12 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花 MON88913及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告
8、- 13 转基因植物及其产品成分检测 抗虫棉花MON15985 及其衍生品种定性 PCR方法 农业部1485 号公告 -14 转基因植物及其 产品成分检测 抗虫转 Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范 农业部 1485号公告 -15 转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米 MON88017及其衍生品种定性 PCR方法 农业部1782号公告- 1 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆 356043及其衍生品种定性 PCR方法 农业部1782号公告- 4 转基因植物及其产品成分检测 高油酸大豆 305423及其衍生品种定性 PCR方法 农业部1782号公告 -5 转基因植物及其产品成分
9、检测 耐除草剂大豆 CV127及其衍生品种定性 PCR方法 农业部1782 号公告 -10 转基因植物及其产品成分检测 转植酸酶基因玉米 BVLA430101构建特异性定性 PCR方法 农业部1782 号公告 -11 转基因植物及其产品成分检测 转植酸酶基因玉米 BVLA430101及其衍生品种定性 PCR方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 农作物种子 农作物的种植材料或者繁殖材料,包括籽粒、果实、根、茎、苗、芽和叶等。 3.2 转基因成分 通过基因工程技术改变农作物遗传构成,被转入到农作物基因组中的外源核酸 序列。 3.3 转基因成分检测方法 依据已知转基因转化事件信
10、息,筛选覆盖同一作物已知转化事件共有元件,并用这些元件快速、大批量筛查农作物种子,定性检测其是否含有转基因成分的检测方法。 DB41/T 12102016 3 3.4 检出限 在给定的置信度内,可从样品中检出待测成分的最小浓度或最小量。 3.5 阴性对照(阴参) 不含待测基因的农作物种子或 核酸 样品。 3.6 阳性对照(阳参) 含待测基因的农作物种子或核酸样品。 3.7 聚合酶链式反应 (PCR) 在反应溶液中,脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在 核酸 聚合酶的作用下进行的催化反应。反应是一个循环的过程:通过加热使双螺旋 核酸 变性成为单链核酸、在合适的温度下引物和目标序列发生退火反应、在合
11、适温度下结合在两条单链上的引物通过核酸聚合酶作用进行 PCR延伸反应。 3.8 引物 一条可互补结合在模板 核酸 链上的短的单链,提供 3-OH末端作为 核酸 合成的起点 , 延伸合成模板核酸 目的片段 。 3.9 内标准基因 (内参 ) 具有物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守核酸 序列。 3.10 空白对照 确知不含待测基因或低于检出限的样品。 4 检测程序 农作物 种子转基因成分检测程序见图 1。 图 1 农作物种子转基因成分检测程序 DB41/T 12102016 4 5 实验室要求及污染防范 按GB/T 19495.2 的规定执行。 6 检测要求 6.1 核酸制备 6.1
12、.1 从送验 样品中分取的试验样品应具有代表性,并有足够的数量。 6.1.2 鲜活样品及被破碎后的样品,应在 -20 下保存。 6.1.3 按照阴性、待测样品、阳性对照顺序提取核酸。 6.1.4 每一份 核酸 样品都应经过质量检测。 6.2 定性 PCR 检测 6.2.1 PCR 反应设置仅模板不同的空白对照、阴性对照、阳性对照至少各 2 个重复, 待检样品 3 个重复,对照与 待检样品 同步反应、检测。 6.2.2 最低检出限为 0.1%,阳性参照的含量为 0.1%。 6.2.3 检测为阳性的样品,可进一步根据转化事件检测方法, 确认转化事件。具体检测方法见 附录 A。 7 仪器和设备 7.
13、1 分样器 。 7.2 样品粉碎机 。 7.3 高速离心机 (转速 12000r/min) 。 7.4 天平( 量程分别为 0.001g, 0.01g, 0.1g) 。 7.5 移液器 (量程分别为 20L, 200L, 1000L) 。 7.6 高压灭菌锅 。 7.7 高恒温烘箱 。 7.8 生物安 全柜 。 7.9 冰箱 。 7.10 微量 核酸 质量检测仪 。 7.11 高速离心机 (转速 6000 r/min) 。 7.12 移液器( 量程分别为 2.5L, 10L, 20L, 100L, 200L, 1000L)。 7.13 超净工作台 。 7.14 制冰 机 。 7.15 不间断电
14、源 。 7.16 PCR循环仪。 7.17 电泳仪和电泳槽 。 7.18 凝胶成像系统。 7.19 超纯水仪。 8 样品预处理 DB41/T 12102016 5 8.1 从送验样品中分取的试验样品应不少于 1000 粒,方法按照 GB/T 3543.2 扦样中实验室分样程序操作。 8.2 分取的样品,应经自来水和无菌水冲洗。 8.3 晾干后,用样品粉碎机 将 分取的试验样品 粉碎至直径大小 0.1 mm 以下 的颗粒 ,充分混匀 ,冷冻备用。 9 核酸提取与纯化 9.1 SDS 法 快速 制备 核酸 9.1.1 试剂 9.1.1.1 无水乙醇( C2H5OH)。 9.1.1.2 37盐酸(
15、HCl)。 9.1.1.3 氯仿 ( CHCl3)。 9.1.1.4 氢氧化钾( KOH)。 9.1.1.5 三羟甲基氨基甲烷( C4H11NO3, Tris)。 9.1.1.6 二水乙二铵四乙酸二钾盐( C10H14N2O8K2 2H2O, K2EDTA2H 2O)。 9.1.1.7 十二烷基磺酸钠( C12H25O4SNa,SDS)。 9.1.1.8 异戊醇 ( C5H12O) 。 9.1.1.9 氯化钠 (NaCl)。 注:所有的试剂均分为析纯。 9.1.2 溶液配制 9.1.2.1 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷 -盐酸溶液( pH 8.0) 称取 121.1 g三羟甲基氨基甲烷溶解
16、于约 800mL水中,用 1 mol/L盐酸溶液调 pH至 8.0,加水定容至1000mL,灭菌备用 。 9.1.2.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钾溶液 (pH 8.0) 称取20.2 g 乙二铵四乙酸二钾,加入约 70mL水中,再加入适量氢氧化钾,加热至完全溶解后,冷却至室温,用 1mol/L氢氧化钾调 pH至 8.0,用水定容至 100mL, 灭菌 备用 。 9.1.2.3 提取 /裂解缓冲液 在约600mL 水中加入 30g十二烷基磺酸钠( SDS),充分溶解后,加入 50mL三羟甲基氨基甲烷 -盐酸溶液, 100mL乙二铵四乙酸二钾溶液,用盐酸或氢氧化钾调 pH至 8.0,加
17、水定容至 1000mL, 灭菌 备用 。 9.1.2.4 5mol/L NaCl 溶液 146.25g固体 NaCl溶于水中, 加水定容至 500mL。 9.1.2.5 TE 缓冲液(pH 8.0) 在约 800mL水中依次加入 10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液, 2mL乙二铵四乙酸二钾溶液,用盐酸或氢氧化钾调 pH至 8.0,加水定容至 1000mL, 灭菌 备用 。 9.1.2.6 洗涤溶液 DB41/T 12102016 6 量取750mL 无水乙醇,加水定容至 1000 mL。 9.1.3 核酸 提取 9.1.3.1 取 30mg80mg 粉 碎后的样品置入 1.5 L 尖底离心管中
18、,加入 600L 裂解溶液, 65C 水浴30min,期间颠倒混匀几次。 9.1.3.2 加入 200L 氯仿,轻柔晃动 5min。12000 r/min 离心 10min。 9.1.3.3 转 450L 上清至一新离 心管中,加入 450L 异戊醇,150 L 5 mol/L NaCL 溶液 ,静置 2 min。 9.1.3.4 混合物分 2 次转入 Spin column 中, 10000r/min 离心 60s。 9.1.3.5 加入 700L 洗涤溶液, 10000r/min 离心 30s。 9.1.3.6 重复 9.1.3.5 一次。 9.1.3.7 Spin column 柱转入新
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