DB22 T 3567-2023 肿瘤基因突变检测——高通量测序技术规范.pdf

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1、 ICS 11.020 CCS C 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 35672023 肿瘤基因突变检测高通量测序技术规范 Technical regulation of next-generation gene sequencing for tumor gene mutation detection 2023-09-28 发布 2023-11-16 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 35672023 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承

2、担识别专利的责任。本文件由吉林省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：吉林大学。本文件主要起草人：姜艳芳、胡欣彤、何佳雪、陈立国、王多、李昂、张鹏、刘勇。DB22/T 35672023 1 肿瘤基因突变检测高通量测序技术规范 1 范围 本文件规定了肿瘤基因突变检测-高通量测序检测技术的生物安全要求、材料与试剂、样本、测序流程、质量控制和废弃物处理。本文件适用于肿瘤基因突变检测的高通量测序检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文

3、件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 YY/T 1723 高通量基因测序仪 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 生物安全要求 4.1 采样及检测过程所涉及的实验操作应按 GB 19489、GB/T 30989、SN/T 1193 规定执行。4.2 为保证生物安全，检测应在指定的区域内进行。区域分区可分为：试剂准备区、样本制备区、打断区、文库制备区、扩增一区、杂交捕获区、扩增二区、测序区等，见图 1。图1 5 材料与试剂 5.1 仪器

4、与耗材 DB22/T 35672023 2 5.1.1 微量移液器：10 L、100 L、200 L、1000 L。5.1.2 微量带滤芯吸头：10 L、100 L、200 L、1000 L。5.1.3 实时荧光定量 PCR 仪。5.1.4 离心管：200 L、1.5 mL、2 mL、10 mL、15 mL。5.1.5 高通量测序仪：高通量测序仪质量应符合 YY/T 1723 的要求。5.1.6 生物分析仪。5.1.7 微量核酸定量仪：可检测低至 10 pg/L 的 DNA。5.1.8 微量分光光度计和荧光分光光度计。5.1.9 基因扩增仪。5.2 试剂 5.2.1 试剂级别：除另有规定，本方

5、法试验用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。5.2.2 核酸提取试剂。5.2.3 荧光 PCR 试剂。5.2.4 RNase A。5.2.5 测序反应通用试剂盒。6 样本 6.1 采集、保存及质量要求 6.1.1 手术组织样本：在显微镜下确认肿瘤细胞所占比例应30%，坏死细胞所占比例应10%，相关的病理检测结果保存备查。新鲜组织样本在含福尔马林或 DNA/RNA 保存液保存，常温下可保存 1 个月。冻存样本需在样本采集后立即放入液氮完全冷冻，-80 低温保存，干冰运输。6.1.2 石蜡组织/切片组织：10%中性福尔马林固定手术标本，按病理学操作规范进行取材。石蜡

6、包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，FFPE 样本的组织面积应介于 0.5 cm21 cm2，切片用量为 5 片10 片，厚度为 5 m10 m，用载玻片片盒或者离心管保存，常温保存、运输。活检材料的固定时间一般是 24 h 以内。6.1.3 外周血：采集外周血提取血浆游离 DNA 进行检测，使用血浆游离 DNA 专用采血管采集外周血 10 mL，在常温条件下，ctDNA 在全血中可稳定保存 7 d。6.1.4 体液：体液中的肿瘤细胞用于基因检测时，需确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给细胞病理检查之后，剩余液体冷藏/冷冻保存，或在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲

7、液室温保存。体液中的 ctDNA 用于基因检测时，使用血浆游离 DNA 专用采血管采集新鲜体液 10 mL。6.2 样本提取 6.2.1 手术组织样本/离心后的体液中肿瘤细胞 应采用常规的DNA/RNA提取试剂盒。6.2.2 石蜡组织/切片组织 宜使用能提取石蜡包埋组织微量DNA/RNA的试剂盒。6.2.3 外周血/体液 DB22/T 35672023 3 检测样本中的ctDNA宜使用ctDNA提取试剂盒。6.3 质量评价 使用微量核酸定量仪、微量分光光度计和荧光分光光度计、生物分析仪或凝胶电泳将样本的核酸提取物进行质量评价。7 测序流程 7.1 文库构建 7.1.1 文库制备方法主要有杂交捕

8、获和扩增子建库，应对检测基因、区域或突变热点进行描述，并建立实验室检测 SOP，按照 SOP 执行。7.1.2 单样本文库分子通常需要经历文库编码、扩增、定量和混合等步骤后进行上机测序。上机前需要对测序文库进行定量和片段大小分析，保证文库质量能满足上机要求。7.1.3 根据检测项目设定文库质量的要求，并明确接受或拒绝的标准。7.2 高通量测序 7.2.1 NGS 测序仪主要有检测氢离子释放和荧光信号两大技术平台。7.2.2 测序时根据检测样本量和质量要求确定适当的芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度。7.2.3 录入芯片编号、测序方案，如读长、单端/双端测序、barcode 信息等内容，按测序仪

9、操作流程进行测序。7.3 生物信息学分析 7.3.1 NGS 数据生物信息学分析可分为以下两个主要步骤：a)对测序数据进行质控分析及过滤。b)对通过质控的序列与参考序列进行比对，对变异位点进行鉴定分析并注释。7.3.2 生物信息学流程中所用各种生物信息分析软件，应通过适量标准品测序数据进行验证，证明所用软件及参数可达到临床报告要求。7.3.3 数据分析的软件应根据指南更新版本。7.4 检测报告 7.4.1 报告内容 报告内容应包括以下内容 c)患者姓名、年龄、住院号/门诊号、送检单位/科室、送检医师、现病史等基本信息。d)样本编号、样本种类、采样日期、送检日期、接收日期。e)检测项目、检测方法

10、、检测范围、检测结果。f)检测者、审核者及报告时间。7.4.2 对检出的基因变异的解释 对检出的基因变异解释应包括如下内容：a)基因变异检测结果。b)用药提示。DB22/T 35672023 4 7.4.3 报告临床意义的解读和批注 对于肿瘤体细胞突变，基因变异宜以下分级方式处理：a)A 级：写入中外诊疗指南有明确诊断/治疗/预后意义的变异。在报告中注释该变异位点的临床诊断/治疗/预后意义的权威指南来源。b)B 级：尚未进入诊疗指南，但已经写入该领域的专家共识的变异位点。注释时要批注研究报道及专家共识的来源，明确其药物及其临床意义、正在开展的状态等信息。c)C 级：批准用于其他肿瘤可预测疗效的

11、基因变异，或者正在进行中的临床试验变异位点。注释时要批注用于其他肿瘤的权威指南，研究文献及临床试验正在开展的状态等信息。d)D 级：处于学术争议或临床意义不明确的基因变异。同一实验室应该有统一的政策用来应对检测过程中出现的临床意义不明变异情况。e)其他内容，如局限性说明、参考文献、检测基因列表等。8 质量控制 8.1 质控品要求 肿瘤高通量测序室内质控应包括阴性质控品、阳性质控品及空白对照。阴阳性质控品可使用试剂盒自带的阴阳性质控品、使用已知突变的患者组织作为阳性质控品或使用正常体细胞DNA作为阴性质控品。空白对照品一般为超纯水。8.2 室内质量控制 8.2.1 制定室内质控计划，在每次检测中

12、至少添加一个阳性质控品、一个阴性质控品与常规标本同时检测，并选定质控规则，保留质控记录。8.2.2 实验室应建立生物信息学室内质量控制程序，在每次更换及更新生物信息学分析软件或版本时进行室内质控，指标和质控参数可包括但不限于标准品的突变类型及百分比。8.2.3 各个质量控制步骤中如出现异常或失败，实验室应建立应对措施或备选方案；对于测序结果质量差或有问题的，应建立替代方法。8.3 室间质量评价 8.3.1 开展肿瘤高通量基因测序的实验室应每年参加室间质量评价活动。8.3.2 室间质量评价结果不合格的应该分析原因，并采取相应的改进措施。9 废弃物处理 9.1 废弃物应经 121 高压灭菌 30 min 后再弃置。9.2 实验室废弃物处理和防止污染的措施应按 SN/T 1193 规定执行。_