DB35 T 1883-2019 无斑玛瑙螺检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS 07.080 B 16 DB35 福建省地方标准 DB35/T 18832019 无斑玛瑙螺检疫鉴定方法 Detection and identification of Achatina immaculata (Lamarck, 1822) 2019 - 12 - 19 发布 2020 - 03 - 19 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 18832019 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 无斑玛瑙 螺基本信息 . . 2 5 鉴定依据 . . 2 6 器具与试剂 . . 2 7 现场检疫

2、 . . 2 8 实验室鉴定 . . 3 9 结果评定 . . 3 10 标本处理和保存 . . 4 附录 A（资料性附录） 无斑玛瑙螺寄主、地理分布及危害性 . 5 附录 B（资料性附录） 无斑玛瑙螺与近似种的鉴别特征比较、成螺形态特征及分子生物学鉴定方法 . 6 DB35/T 18832019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由福州海关提出并归口。 本标准起草单位：福州海关。 本标准主要起草人：王沛、胡美玲、周卫川、林阳武。 DB35/T 18832019 1 无斑玛瑙螺检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了无斑玛瑙螺 Achatina immacul

3、ata (Lamarck,1822)的检疫鉴定方法。 本标准适用于无斑玛瑙螺的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注文件的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 3067 2011 软体动物常规检疫规范 3 术语和定义 SN/T 30672011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 体螺层 body whorl 贝壳的最后一个螺层。 注： 体螺层一般较大，容纳动物的头部和足部。 3.2 壳顶 apex 螺旋部顶端。 注： 壳顶是动物最早的胚壳，其形状有钝圆、尖锐、

4、扁平等，有些种类的壳顶常被腐蚀磨损。 3.3 壳口 aperture 体螺层末端的开口。 注： 壳口为动物头和足的出口。 3.4 口唇 lip 壳口的边缘。 注：口唇按其在壳口的位置不同可分为内唇、外唇、轴唇、上唇和下唇。 3.5 脐孔 umbilicus 贝壳旋转时在末端遗留下的一个小窝。 注： 有些贝壳的脐孔封闭或被遮盖。 DB35/T 18832019 2 3.6 COI基因 cytochrome oxidase subunit I gene 线粒体细胞色素C氧化酶亚基I。 注： 该基因常被应用于系统发育和DNA条形码研究，是软体动物DNA条形码的靶标基因，广泛应用于软体动物的分子 鉴定

5、。 4 无斑玛瑙螺基本信息 以下列出无斑玛瑙螺的基本信息，其他信息参见附录A。 中文名：无斑玛瑙螺 。 英文名：Pink-lipped agate snail。 学名： Achatina immaculata (Lamarck, 1822)。 分类地位：软体动物门(Mollusca)，腹足纲 (Gastropoda)，肺螺亚纲(Pulmonata)，柄眼目 (Stylommatopgora)， 玛瑙螺科(Achatinidae)，玛瑙螺属( Achatina)。无斑玛瑙螺的近似种主要有非洲 大蜗牛( A. fulica Bowdich, 1822)和虎斑玛瑙螺 A. achatina (Lin

6、naeus, 1758)（参见附录B中的表 B.1）。 5 鉴定依据 传播方式和传播途径是确定现场检疫的依据。贝壳、螺体形态特征和分子生物学特性是实验室鉴定 的依据。 6 器具与试剂 6.1 器具 体视显微镜、放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4 mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、 白瓷盘、培养皿、镊子、剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针、解剖腊盘、标签、移液枪、微型离心机、 PCR仪、1.5 ml离心管、 0.2 ml PCR反应管、恒温金属浴、低温冰箱。 6.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、PCR Master Mi

7、x、ddH 2O。 7 现场检疫 7.1 仔细观察来自疫区的运输工具的底部和四角部位以及所装货物与木质包装材料是否有蜗牛，尤其 要注意阴暗蔽光处，对可能被蜗牛污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查。对来自疫区的原木、盆景、 苗木、水果等未经加工的植物性原材料也应认真检查。发现蜗牛，随时装入塑料自封袋或标本瓶带回实 验室做进一步的检验鉴定（参见附录 A）。 7.2 蜗牛爬行过后，一般都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。 发现盆景等携带土壤或其它细碎衬垫材料时，应过筛检查是否有卵或幼螺。 DB35/T 18832019 3 8 实验室鉴定 8.1 测量、观察和饲养 用游标

8、卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察螺的形态特征，例 如壳顶、螺纹、壳口、脐孔等。单独查获的卵粒和幼螺，按照SN/T 30672011中8.4方法，将其孵化和 饲养为成螺后，再做鉴定。 8.2 玛瑙螺属鉴定特征 贝壳呈长卵圆形，具有圆锥形的螺旋部，胚螺层23个，小，圆锥形，光滑；壳口呈卵圆形。壳轴 下面呈截断状。肺相当粗壮，肺脉管无大的分枝，但具有稠密的侧枝；颚片具有稠密的螺纹；齿舌中板 窄，侧板具有大的尖角，并有一外齿尖。在缘齿上无特殊的内齿尖。阴茎无独特的鞘。牵引肌是一条右 触角肌。 8.3 无斑玛瑙螺鉴定特征 8.3.1 卵 卵粒圆形或椭圆形，长4.5 mm6

9、.5 mm，宽4 .0 mm5.0 mm，乳白色，稍硬，珍珠般光泽。 8.3.2 贝壳 8.3.2.1 成螺 贝壳大型，壳高100 mm165 mm，壳宽 40 mm85 mm。右旋，长圆锥状，壳质厚，坚实，表面分 布少量短而弯曲的、轴向排列的沟槽。贝壳螺旋部高，壳顶钝圆，胚螺层光滑，随着个体的生长逐渐变 白。螺层79个，各螺层圆凸，壳表为棕黄色或灰白色，大部分有深棕色至暗红褐色的纵向略直条纹。 刻纹粗，靠近缝合线处不规则且略呈齿状。螺纹稠密，与略弯曲的沟槽交叉。体螺层膨大，表面粗糙， 内层表壳灰白色。壳口宽，简单，锋利，易碎，为卵圆形。口唇外唇不增厚，不外折，内唇贴覆于体螺 层上，形成粉红色

10、的薄胼胝部。壳口内唇、外唇内侧和螺轴均为粉红色，无脐孔（参见附录B中的B.2）。 8.3.2.2 幼螺 幼螺贝壳外形与成螺相似，但个体小，壳质薄，易碎，且无弯曲粗大的纵向条纹。 8.3.3 螺体 螺体足部肌肉发达，一般为黑褐色，背面呈暗棕黑色，蹠面呈灰黄色，成螺时则转灰白色，粘液无 色。 8.3.4 分子生物学鉴定 参照附录B中的B.3方法提取DNA、PCR扩增和测序，将所测序 列与Genbank登录号为MH898869已知无 斑玛瑙螺的COI基因序列进行比对，一致性宜95%。 9 结果评定 以贝壳形态为基本鉴定依据，螺体形态为辅助鉴定特征，并注意与近似种鉴别，符合8.3.2或同时 符合8.3

11、.3形态特征的蜗牛鉴定为无斑玛瑙螺。单独查获的卵粒符合8.3.1形态特征，应通过孵化和饲养 DB35/T 18832019 4 实验（参见SN/T 30672011中8.4），做进一步 的鉴定。符合8.3.4作为前期初筛或最终鉴定结果的分 子佐证。 10 标本处理和保存 10.1 标本处理 10.1.1 闷杀 将蜗牛置于盛满水的瓶中，盖上瓶盖，蜗牛在慢慢窒息的过程中逐渐伸展身体死亡；或在盛水的瓶 中逐渐加入少量硫酸镁，进行麻醉闷杀。 10.1.2 固定和保存 将闷杀后软体伸展的蜗牛标本置于75%的乙醇溶液中固定，每隔1 d2 d换1次乙醇溶液，共换3 4次，便可长期保存于75%的乙醇溶液中。对

12、于鉴定为无斑玛瑙螺的样品则置于无水乙醇溶液中，在 -70 -20 的低温下长期保存。 10.2 标本保存 经处理后的标本，至少妥善保存6个月，并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。 DB35/T 18832019 5 B A 附 录 A （资料性附录） 无斑玛瑙螺寄主、地理分布及危害性 A.1 寄主 无斑玛瑙螺寄主植物达500种，包括草本、木本和藤本植物,例如花生、龙眼、槟榔等。 A.2 地理分布 斯威士兰、莱索托、津巴布韦、马拉维、莫桑比克、马达加斯加等非洲东南部国家和地区。 A.3 危害性 无斑玛瑙螺食性杂，寄主植物广泛，几乎无所不吃，包括林木、果树、灌木、蔬菜、花卉和各种草 本植物，也取

13、食纸张和同伴尸体。在自然界，以取食蔬菜、草本花卉为主的种群数量大，对农作物破坏 也严重。无斑玛瑙螺对绿色植物也有喜嫩性，一般喜食鲜嫩植物或植物的幼嫩部分，所以在田间受害最 严重的往往是蔬菜瓜果和鲜嫩多汁的鲜切花，作物被害典型症状是成孔洞或咬断幼芽和嫩枝。此外，无 斑玛瑙螺也是许多重要人畜共患寄生虫病的中间宿主，危害极大。除了危害农作物和传播人畜疾病外， 无斑玛瑙螺还危害建筑物。该螺为了生长坚硬的贝壳，可取食水泥和石灰，还可危害桥墩。 B DB35/T 18832019 6 附 录 B （资料性附录） 无斑玛瑙螺与近似种的鉴别特征比较、成螺形态特征及分子生物学鉴定方法 B.1 无斑玛瑙螺与近似种

14、鉴别特征比较 表B.1给出了无斑玛瑙螺与近似种的鉴别特征。 表B.1 无斑玛瑙螺与近似种鉴别特征比较 特征 无斑玛瑙螺 A. immaculata 非洲大蜗牛 A. fulica 虎斑玛瑙螺 A. achatina 螺层数 59 6.58 78.5 壳面斑纹 深棕色或暗红色，略直，轴缘粉 红色 褐色或白色，轴缘灰褐色 Z 字形火红色斑纹，轴缘粉红色 壳顶螺旋部 灰白色 淡白色 淡褐色 贝壳形态 DB35/T 18832019 7 B.2 无斑玛瑙螺成螺形态特征 无斑玛瑙螺成螺形态特征如图B.1所示。 图中左侧为无斑玛瑙螺成螺贝壳正侧面，右侧为无斑玛瑙螺成螺贝壳背侧面。 图B.1 成螺贝壳形态特

15、征 C B.3 无斑玛瑙螺分子生物学鉴定方法 B.3.1 DNA提取 取适量无斑玛瑙螺腹足肌肉，用SDS方法或动物基因组DNA试剂盒方法提取DNA。 B.3.2 COI基因引物 LCO1490：5 -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3； HCO2198：5 -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3。 DB35/T 18832019 8 B.3.3 反应体系 反应体系为20 l：其中DNA模板2 l（100 ng/l），LCO1490(10 M)0.5 l，HCO2198( 10 M)0.5 l， 2Master Mix 10 l，ddH 2O 7 l。 B.3.4 PCR扩增条件 94 5 min；94 50 s，45 30 s， 72 50 s，3035个循环；72 10 min，4 。 B.3.5 测序 将PCR扩增样品送有资质的生物技术公司测序。 B.3.6 比对鉴定 将测序获得的DNA序列，经软件拼接和人工校对后，与Genbank登录号为MH898869已知无斑玛瑙螺的 COI基因序列进行比对，一致性95%的待鉴样品确定为无斑玛瑙螺的疑似样品。 _ DB35/T 18832019 福建省地方标准 无斑玛瑙螺检疫鉴定方法 DB35/T 1883 2019 * 2019 年 12 月第一版 2019 年 12 月第一次印刷