第六章 发酵过程控制.ppt

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1、第六章 发酵过程控制,第一节 温度控制 第二节 pH值控制 第三节 泡沫控制 第四节 补料控制 第五节 菌浓和基质对发酵的影响 第六节 二氧化碳和呼吸商 第七节 微生物发酵终点的判断,重点：温度控制；发酵热；温度对发酵的影响； pH值的控制；pH值对菌生长和代谢产物形成的影响；影响pH变化的因素；发酵过程中pH的调节及控制；泡沫的控制；发酵过程中泡沫的变化；补料的控制；菌体浓度对发酵的影响与控制；基质对发酵的影响；二氧化碳对菌体生长和发酵的影响；呼吸商与发酵的关系；发酵终点的判断。,发酵过程的主要控制参数 pH值： 显示发酵过程中各种生化反应的综合结果。 温度：不同的菌种，不同产品，发酵不同阶

2、段所维持的温度亦不同。 溶氧浓度（DO值，简称溶氧）：一般用绝对含量(mgL)来表示，有时也用在相同条件下氧在培养液中饱和度的百分数()来表示。 基质含量：定时测定糖(还原糖和总糖)、氮(氨基氮或铵氮)等基质的浓度。, 空气流量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，也叫通风比。一般控制在0.51.0 L(Lmin)。 压力：罐压一般维持在0.020.05 MPa。 搅拌转速：控制搅拌转速以调节溶氧。以每分钟的转数表示。 搅拌功率：常指每立方米发酵液所消耗的功率(kWm3)。 黏度：细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况，通常用表观黏度表示之。, 浊度：澄清培养液中

3、低浓度非丝状菌的OD值与细胞浓度成线性关系。一般采用分光光度计的波长420660 nm测量，要求吸光率0.30.5。波长600700 nm间，一个吸光率单位大约相当于1.5 g细胞干重L。浊度对氨基酸、核苷酸等产品的生产是极其重要的。 (11) 料液流量 (12) 产物的浓度： (13) 氧化还原电位：限氧条件发酵用氧化还原电位参数控制则较理想。 (14) 废气中的氧含量：从废气中的氧和CO2的含量可以算出产生菌的摄氧率、呼吸商和发酵罐的供氧能力。,(15) 废气中的CO2含量：揭示产生菌的呼吸代谢规律。 (16) 菌丝形态：衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期长短

4、的依据之一。 (17) 菌体浓度：是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵。常根据菌浓来决定适合的补料量和供氧量。由以上参数计算得出的菌体生长比速、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生成速率也是控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件的主要依据，多用于发酵动力学的研究。,第一节 温度控制 1 发酵热伴随发酵的进行而产生的热量叫发酵热；发酵热的产生引起发酵液温度变化。在发酵过程中，某些因素导致热的产生，另外一些因素又导致热量散失。产热散热 净热量堆积 发酵液的温度上升；相反，产热小于耗热，温度下降。下面具体分析产热和散热的因素。,1) 生物热Q生物,在发酵过

5、程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,生物热与发酵类型有关,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多 一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水 好氧：产生287.2千焦耳热量，183千焦耳转变为高能化合物104.2千焦以热的形式释放 厌氧：产生22.6千焦耳热量，9.6千焦耳转变为高能化合物13千焦以热的形式释放 二个例子中转化为高能化合物分别为63.7和42.6,特点： 具有时间性； 具

6、有生物特异性； 与营养有关；如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。,2) 搅拌热Q搅拌,在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：Q搅拌P8604186.8（焦耳/小时）P搅拌轴功率 1千瓦时8604186.8焦耳,散热的情况：蒸发热：空气经发酵液时，发酵液中有部分水汽化，变成水蒸气，随空气一起排出罐外，这部分水汽化时带走的热量用Q蒸发表示，假设进出口气体温度相同，则由通气带走的热量为：Q蒸

7、发=G（I出-I进），G：空气流量；I：气体热焓；辐射热：通过罐体表面向环境中发射红外线而散失的热量。热量的大小决定于罐内外温度差大小、罐的表面积等。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5。 发酵过程中，发酵液温度变化取决于上面几个因素：Q发酵 = Q生物 + Q搅拌 - Q蒸发 - Q辐射,2 发酵热的测量及计算 发酵热的测定可采用以下几种方法： 利用热交换原理: 测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵 = G*Cm（t2 t1）/VCm水的比热 G冷却水流量 利用温度变化率S（/h）：先使罐温恒定，再关闭自控装置，测量S，根据Q发酵 = （M1*C

8、1 + M2*C2）S,热力学方法：根据盖斯定律：“在恒压和横容条件下，一个反应不论是一步完成或几步完成，其反应热是相同的”。这实际上是热力学第一定律的必然推论，因为焓（H）是状态函数，过程的焓变与途径无关，只决定于过程的始态和终态。发酵热可根据标准燃烧热或标准生成热来计算。H（H）反应物（H）产物计算时，首先查出发酵所用的各种原料及产物的标准生成热或燃烧热，再根据实际发酵中，各原料的消耗及产物的生成量，利用上述公式即可求出过程的焓变。,3 温度对微生物生长的影响任何微生物的生长温度均在一定范围内，可用最高温度、最适温度和最低生长温度进行描述；温度影响微生物生长的机理(1)影响酶活性。(2)影

9、响细胞膜的流动性。(3)影响物质的溶解度。,在微生物培养过程中，生长速率的变化可描述为：,上式表明：实际比生长速率是生长与死亡速率平衡的综合反映。,、均与温度有关，其关系可由Arrchnius公式来描述：,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长,葡萄糖过量的培养基上温度对大肠杆菌生长比速的影响,温度对微生物生长的影响具体表现在： (1)有最适宜温度范围。 (2)高温使蛋白质凝固。耐热能力与pH值有关。,T,V,最低,最适,最高,微生物的生长温度与

10、细胞膜的液晶温度范围相一致。液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态。 酶在低温条件下的结构完整性和催化功能 不能低温合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。 低温微生物可合成冷休克蛋白 微生物受高温的伤害比低温的伤害大，低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,4 温度对发酵的影响 (1)影响产物生成速度 (2)影响发酵液性质 (3)影响产物种类 a.改变体内酶系中间产物种类产物种类; b.使代谢比例失调； (4)影响产物特性,影响合

11、成方向：用米曲霉制曲时，如温度在低限时，得到蛋白酶，此时-淀粉酶的合成受到抑制。金色链霉菌在低于30C时合成链霉素，温度到达35C时，只产四环素 影响产物生成量：黑曲霉生长最适温度33-37C，积累柠檬酸的最适温度在32C 影响产物质量：凝结芽孢杆菌合成-淀粉酶时，发酵温度控制在55时，合成的-淀粉酶较耐高温，在90、60min条件下，其活性丧失仅10左右，而发酵温度控制在35时，合成的-淀粉酶在相同条件下丧失90。,温度对菌的生长、产物合成的影响可能是不同的,120C300C,5 温度的控制由于微生物在生长和发酵过程中，对温度有以上要求，在生产上，为获得较高的生产率，针对所用菌种的特性，在发

12、酵周期的各阶段需要进行温度控制，提供该阶段微生物活动的最适温度。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,最适温度的选择,1）根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为370C， 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C， 青霉菌生长温度为300C。,前期菌量少，取稍高的温度，使菌生长迅速； 中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产

13、物合成。 后期产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。,如： 四环素生长阶段280C，合成期260C后期再升温； 黑曲霉生长370C，产糖化酶32340C。 但也有的菌种产物形成比生长温度高谷氨酸产生菌生长30320C，产酸34370C。 最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,例：林可霉素发酵的变温培养,问题的提出 接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期 主要问题： 如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？ 适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在

14、,变温培养的正交设计,结论：前60h按31控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础 60小时后将罐温降至3O使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素 发酵进入后期罐温再回升至31 使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。,2）根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3）根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高

15、温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。 总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,利用温度控制提高产量的实例：热冲击处理技术提高发酵甘油的产量,实验：正交条件A 冲击温度（0C） 40，45，50B 开始时机（h） 8，16，30C 冲击时间（分） 15，30，60,结果发酵16小时，450C冲击30分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高32.6。 （A）16h,450C,30min （B）12h,450C,30min,第二节 pH值的控制 1 pH值对菌体生长和代

16、谢产物形成的影响pH表示溶液氢离子浓度的负对数，纯水的H+浓度是10-7mol/L，因此pH为7，pH7呈碱性，pH7呈酸性，pH值差1时，其H+浓度就相差10倍。最高、最适、最低三基点，主要是影响微生物活动环境的离子强度、细胞膜的透性及膜上的带电性和氧化-还原电位、酶活性。,不同种类微生物，对pH要求不同；,酵 母：pH 3.86.0,细 菌：pH 6.57.5,霉 菌：pH 4.05.8,放线菌：pH 6.58.0,同种微生物对pH变化的反映不同。 如，石油代蜡酵母,pH 3.55.0 生长良好，不易染菌；,pH 5.0时，易染细菌；,pH 3.0时，生长受抑制，易自溶；,pH不同，微生物

17、代谢产物不同。,黑曲霉,pH：23，柠檬酸 发酵,pH：7.0，草酸发酵,谷氨酸菌,pH：78，GA发酵,pH：5.05.8，谷氨酰胺发酵,酿酒酵母,pH：4.5-5.03，乙醇 发酵,pH：8.0，甘油发酵,pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,pH对菌体生长影响比产物合成影响小 例 青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适pH7.27.4四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适pH5.86.0,X,pH,微生物生长和发酵的最适宜pH可能不同。,丙酮丁醇菌,生长：pH 5.57.0;,发酵：pH 4.3-5.3;,链霉素菌,生长： pH 6.3-6.9,发酵

18、： pH 6.7-7.3,青霉素菌,生长：pH 6.5-7.2,发酵：pH 6.2-6.8,影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；,pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 影响氧的溶解和氧化还原电势的高低； pH值影响孢子发芽；,举例： 影响菌体的生长：产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减小：其菌丝直径在pH6.0时为23 m；pH7.4时为218 m，并呈膨胀酵母状；pH

19、值下降后菌丝形态又会恢复正常。 影响产物合成：合成青霉素的最适pH值范围为6.56.8。,影响产物稳定性：-内酰胺抗生素沙纳霉素的发酵中，pH在6.77.5之间时抗生素的产量相近，高于或低于这个范围，合成受到抑制。在这个pH值范围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响；但pH7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳定性有关。,2 影响pH值变化的因素 在发酵过程中，pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。在产生菌的代谢过程中，菌体本身具有一定的调整周围环境pH值，构建最适pH值的能力。,以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究

20、，采用pH值为6.0、6.8、7.5三个出发值，结果发现： pH值在6.8、7.5时，最终发酵pH值都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平； pH值为6.0时，发酵中期pH值只达4.5，菌浓仅为20，发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。,1）基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一 （2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 （3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,如灰黄霉素发酵的pH值变化，就与所用碳

21、源种类有密切关系，如以乳糖为碳源，乳糖被缓慢利用，丙酮酸堆积很少，pH值维持在67之间；如以葡萄糖为碳源，丙酮酸迅速积累，使pH值下降到3.6，发酵单位很低。,2）产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,3）菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,引起发酵液pH值变化的常见因素 (1)下降 培养基中C/N不当，有机酸积累； 消沫油加得过多； 生理酸性物质过多； (2)上升 C/N比例不当，N过多，氨基氮释放； 生理碱性物质过多； 中间补料时碱性物加入量过大；,发酵液的pH值变化是菌体代谢反应的综合结

22、果。 从代谢曲线的pH值变化就可以推测发酵罐中的各种生化反应的进展和pH值变化异常的可能原因。 在发酵过程中，要选择好发酵培养基的成分及其配比，并控制好发酵工艺条件，使pH值稳定维持在最佳的范围内。,4 发酵过程中pH值的调节及控制 1） 发酵pH值的确定（范围，时间） 一般是在58之间，如谷氨酸发酵的最适pH值为7.58.0。 随菌种和产品不同而不同。同一菌种，生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。 按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH，使产量最大。,例 pH对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。

23、若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。,pH,7.0,t,不调pH,调pH,效价,pH,黑曲霉pH23时合成柠檬酸，pH值接近中性时积累草酸。 谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下形成谷氨酰胺。谷氨酸发酵在不同阶段对pH值的要求不同，发酵前期控制pH7.5左右，发

24、酵中期pH7.2左右，发酵后期pH7.0，在将近放罐时，pH6.56.8为好。 梭状芽孢杆菌丙酮丁醇发酵，pH值在中性时，菌种生长良好，但产物产量很低，实际发酵最适pH值为56。 链霉素产生菌生长最适pH值为6.27.0，合成最适pH值为6.87.3。,最适pH值的确定：根据实验结果不同的pH值出发进行发酵，发酵过程中定时测定和调节pH值以维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基来维持。定时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为生长最适pH。同样的方法可测得产物合成的最适pH值。但同一产物的最适pH值，还与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。确定发酵最适pH值时，要考虑温度的影响

25、。,最佳pH的确定,配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况,pH对产海藻酸裂解酶的影响,pH对海藻糖水解酶产生的影响,pH菌浓 pH酶活,pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响,在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值、菌体的比生长速率()和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况(见图10-1)： 和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a)，这种发酵过程易于控制； Qp (或)的最适pH值范围窄，而(或Qp)的范围较宽(b)； 和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的(c)，第二、第三种情况的发酵pH值应严格控制； 和Qp有各自的最适pH值(d)，应分别严格

26、控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。,在发酵过程中，发酵液的pH随着微生物活动而不断变化，为提供菌体适宜的生长或产物积累的pH值，需要对发酵生产过程各阶段的pH值实施控监控，实际生产中，从以下几个方面进行：（一）调整培养基组分：适当调整C/N比，使盐类与碳源配比平衡，一般情况：C/N高时（真菌培养基），pH降低；C/N低时（一般细菌），经过发酵后，pH上升,在生产上，主要的过程控制方法有：添加CaCO3：当用NH4+盐作为氮源时，可在培养基中加入CaCO3，用于中和NH4+被吸收后剩余的酸.氨水流加法：氨水可以中和发酵中产生的酸，且NH4+可作为氮源，供给菌体营养.通氨一般是使压缩氨气或工

27、业用氨水(浓度20左右)，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，故需避免使用铜制的通氨设备。,尿素流加法：味精厂多用，尿素首先被菌体尿酶分解成氨，氨进入发酵液，使pH上升，当NH4+被菌体作为氮源消耗并形成有机酸时，发酵液pH下降，这时随着尿素的补加，氨进入发酵液，又使发酵液pH上升及补充氮源，如此循环，致至发酵液中碳源耗尽，完成发酵。氨基酸发酵常用此法。这种方法既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可

28、以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。,pH的控制方法 常用方法,调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5-6.8在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等通过补料调节pH,在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH，如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH(2)当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,应急措施： 改变搅拌

29、转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度； 改变温度，以控制微生物代谢速度； 改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量； 改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；,分别在4种缓冲介质中，于pH 650一950测定天冬酰胺酶酶活力 1 甘氨酸介质pH 8.00时酶活力最高； 2 硼酸在pH 850，酶反应最快 3 磷酸在pH 850，酶反应最快 4 Tris在pH 850，酶反应最快 酶活1243,5、不同调pH方法的影响,天冬酰胺酶,不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3

30、”表示CaC03和尿素联合控制pH值。,异亮氨酸发酵,例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响,菌株最适生长pH控制在6.87.0,6 发酵的不同阶段采取不同的pH值,pH69时，菌体生长旺盛，pH715时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为715，到80h后pH值为725。产率2227g/L，产酸率提高1223。,例：克拉维酸发酵中pH变换控制,问题：在pH低时菌体生长受抑制，在高pH时克拉维酸要分解,用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH降至6.5。在达到最高细胞

31、浓度后，pH开始从6.5升至8.3。CA产量达最高水平时，pH不再升高。在发酵终止时，pH再次升至8.5。随着pH升高，CA迅速分解。,pH8.0时生长良好 产量低，产物降解,pH7.0时的状况,研究不同pH对发酵的影响 分别配置pH为6.0，7.0，8.0的培养基测定菌的生长和产物合成,pH6.0时，生长受抑制，产物降解少,控制pH7.0和8.0时，最高细胞浓度接近相同(约16PMV)，但控制pH60时细胞生长受抑制。 在25升生物反应器内， 不控制pH时247g(mLh ) 控制pH7.0时的产率337g(mLh) 最高 控制pH8.0时，产率202g(mLh) 在控制pH60时，CA产生

32、被抑制,但降解少 因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0，但在控制pH7.0时，仍出现CA的迅速分解。,由于CA生产的最适pH和减少CA分解的pH各不相同，因此在分批发酵中应用了pH变换策略，使发酵pH由中性pH70变换为酸性pH6.0。在发酵前期，在细胞生长和产生CA期间控制pH7.0，4d后，当CA产量达最高值时，变换pH为6.0，以减少CA分解。最高CA浓度可保持24h。由于改变pH，使CA分解速率明显降低。,小 结,发酵过程pH会发生变化,基质代谢,产物形成,菌体自溶,pH,pH影响酶的活性 pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变 pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离 pH

33、影响代谢方向,pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,pH的控制方式,基础培养基调节pH 在基础料中加入维持pH的物质 通过补料调节pH 当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 选择合适的pH调节剂 发酵的不同阶段采取不同的pH值,第三节 泡沫的控制 1 泡沫的产生、性质及变化形成条件： 气-液两相共存； 表面张力大的物质存在；,发酵过程中泡沫有两种类型： 一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫； 另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫(fluid foam)，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限。,实质：气溶胶构成的胶体系统，其分散相

34、是空气和代谢气，连续相是发酵液，泡沫间隔着一层液膜而被彼此分开不相连通。,泡沫是热力学不稳定体系,热力学第二定律指出：自发过程，总是从自由能较高的状态向自由能较低的状态变化。起泡过程中自由能变化如下：,G=A G自由能的变化 A表面积的变化 比表面能,起泡时，液体表面积增加，A为正值，因而G为正值，也就是说，起泡过程不是自发过程。另一方面，泡沫的气液界面非常大。例如：半径1cm厚0.001cm的一个气泡，内外两面的气液界面达25cm2；可是，当其破灭为一个液滴后，表面积只有0.2cm2,相差上百倍。泡沫破灭、合并的过程中，自由能减小的数值很大。因此泡沫的热力学不稳定体系，终归会变成具有较小表面

35、积的无泡状态。,发酵过程泡沫产生的原因,（1）通气搅拌的强烈程度,发酵前期培养基成分丰富，易起泡。 采用较小通气量及搅拌转速，再逐步加大。 也可在基础料中加入消泡剂。,（2）培养基配比与原料组成,前期培养基营养丰富粘度大，产泡沫多而持久。 例：在50L罐中投料10L，成分为淀粉水解糖、豆饼水解液、玉米浆等，搅拌900 rpm，通气，泡沫生成量为培养基的2倍。如培养基适当稀一些，接种量大一些，生长速度快些，前期就容易搅拌开。,（3）菌种、种子质量和接种量,菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量,（4）灭菌质量,培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，

36、抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。,泡沫的形成一般有以下几种规律： 整个发酵过程中，泡沫保持恒定的水平； 发酵早期，起泡后稳定地下降，以后保持恒定； 发酵前期，泡沫稍微降低后又开始回升； 发酵开始起泡能力低，以后上升；,泡沫体系的三阶段变化,(1)气泡大小分布的变化液膜包裹的一个气泡，就像一个吹鼓了的气球。由于气球膜有收缩力，所以气球中压力大于气球外的压力；同样气泡膜有表面张力，气泡中压力大于气泡外的压力。气泡大小的再分布，就是由气泡膜内气体的压力变化引起的。气泡中气体压力的大小，依赖气泡膜的曲率半径,（2）气泡液膜变薄,取一杯泡沫，放置一段时间，就会在杯底部出现一

37、些液体，而逐渐形成液相及液面上的泡沫相这样具有界面的两层。底部出现的液体一部分是泡沫破灭形成的，一部分是气泡膜变薄，排出液体形成的。泡沫生成初期，泡沫液还比较厚，以后因蒸发排液而变薄，泡沫液会受重力的影响向下排液，泡沫液随时间延续而变薄。,（3）泡沫破灭,泡沫由于排液，液量过少，表面张力降低，液膜会急剧变薄，最后液膜会变得十分脆弱，以至分子的热运动都可以引起气泡破裂。因此只要泡沫液变薄到一定程度，泡沫即瞬间破灭。泡沫层内部的小气泡破灭后，虽一时还不能导致气液分离，只是合并成大气泡，但排液过程使泡膜液量大幅度减少，使合并成的大气泡快速地破灭，最后泡沫体系崩溃，气液分离。,影响泡沫稳定性的因素,引

38、起危害，需要消除的，只是稳定的泡沫。泡沫的稳定性受液体、气体许多性质的影响。不同介质的泡沫，稳定程度相差很多，影响泡沫稳定性的因素十分复杂，概括国内外研究者的说法，主要因素一下几种,1）泡径大小,大泡易于破灭，寿命较长的的都是小泡。 因为： 泡越小，合并成大气泡的历程就越长； 小气泡的泡膜中所含液量相对比较大，所以较能经受液体流失所造成的稳定性的损失； 气泡越小，上升速度越慢，给表面活性剂的吸附提供充足的时间，增加了稳定性。,2）溶液所含助泡物的类型和浓度,（1）降低表面张力降低表面张力会降低相邻气泡间的压差。压差小，小泡并入大泡的速度就慢，泡沫的稳定性就好。,（2）增加泡沫弹性助泡的表面活性

39、剂，吸附在气液界面上，使表面层的组分与液相组分产生差别，因而使泡沫液具有弹性。,（3）助泡剂浓度,溶液中助泡剂浓度增加，气液界面上的吸附量就增加，液膜弹性随之增加，泡沫稳定性增高。到达临界胶束浓度后，气液界面上的定向排列“饱和”，弹性不会再增加。,3）起泡液的粘度,某些溶液，如蛋白质溶液，虽然表面张力不高，但因粘度很高，所产生的泡沫非常稳定。因为粘稠的液膜，有助于吸收外力的冲击，起到缓冲的作用，使泡沫能持久一些。液体粘度对泡沫稳定性的影响比表面张力的影响还要大。,4）其它,*温度 表面张力最低值时的浓度随温度变化。 *pH 影响助泡剂的溶解度和表层的吸附状态 *表面电荷 离子型表面活性剂，由于

40、离子间静电的排斥，阻碍着离子彼此接近，减少排液速度，延缓泡沫变薄过程，使泡沫稳定。,2 泡沫对发酵的影响,1）降低生产能力,在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量,2）引起原料浪费,如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。,3） 影响菌的呼吸,如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。,4） 引起染菌,由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂

41、菌污染。,3 泡沫的控制 泡沫的控制，可以采用三种途径： 调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。, 采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫：通过化学方法，降低泡沫液膜的表面张力，使泡沫破灭；利用物理方法，使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原来受力平衡而破裂。, 采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素 如：杂交选育不产流态泡沫的土霉素生产菌株对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同

42、时使用消泡。,化学消泡这是利用外界加入消泡剂，使泡沫破裂的方法。消泡剂都是表面活性剂，具有较低的表面张力，或者是降低泡沫液膜的机械强度，或者是降低液膜的表面黏度，或者兼有两者的作用，达到破裂泡沫的目的。如聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)的表面张力仅为3.310-2 Nm，而青霉素发酵液的表面张力为(6.06.8)10-2 Nm。,1）消泡剂的作用机理,为了弄清消泡剂如何发挥作用，为了合理、有效地使用消泡剂，需要了解消泡剂的作用机制及一般性质。分别介绍在消泡剂发展历史上有重要地位的罗氏假说以及其它几种消泡剂的作用机理。,铺展系数S：S=FFAA F起泡介质的表面张力 FA消泡剂与起泡介质的界面张力

43、A消泡剂的表面张力 以铺展系数S值的正负判断消泡剂是否能够在泡沫上扩展。,A,FA,F,浸入系数E：E=,以浸入系数E值的正负判断消泡剂能否进入泡沫表面。,A,FA,F,美国胶体化学家罗斯（Ross,S.）提出假说：在溶液中，溶解状态的溶质是稳泡剂；不溶状态的溶质，当浸入系数与铺展系数均为正值时即是消泡剂。 罗斯认为，消泡剂的分子团，即一小滴，一接触泡沫，首先便是浸入，之后在泡沫上扩展，局部变薄而破裂。当浸入系数和铺展系数均为负值时，小滴既不浸入也不扩展；当浸入系数大于零，铺展系数为负数时小滴成棱镜状，不铺展；只有二者均为正值时才可能是消泡剂，这种假说为消泡剂作用机理奠定了基础。,2）与稳泡因

44、素有关的几种消泡机理,a、消泡剂可使泡沫液局部表面张力降低，因而导致泡沫破灭希勒（Shearer,L.T）和艾克斯(Akers,W.W.)在油体系中研究聚硅氧烷油的消泡过程。他们对泡沫体系以1/1000秒的速度连续拍照，照片放大100倍,由图可以看出，硅油微粒到达泡沫表面使泡沫破灭，气泡合并，气液迅速分离。 研究发现：低浓度的，表面张力比起泡液低的物质，如果与起泡液成为均相，则促进起泡；如果呈饱和状态，而且被均匀分散在起泡液中，就可能有消泡作用。附着了消泡剂小滴的泡沫能够迅速破灭，与局部降低表面张力有关。,日本高野信之提出类似的观点：在起泡液中分散的消泡剂颗粒，随着泡沫液变薄，露到表面，因消泡

45、剂表面张力比泡沫液低，该处受到周围的拉伸、牵引。不断变薄，最后破灭。,把高级醇或植物油洒在泡沫上，当其附着到泡沫上，即溶入泡沫液，会显著降低该处的表面张力。因为这些物质一般对水的溶解度较小，表面张力降低只限于局部，而泡沫周围的表面张力几乎没有发生变化。表面张力降低的部分，被强烈地向四周牵引、延展，最后破裂。,b、消泡剂能破坏膜弹性而导致气泡破灭,稳泡因素中谈到，因泡膜表面吸附表面活性剂具有斯弹性，当受到外部压力时有自愈作用。消泡剂能破坏泡膜的这种弹性。离子型表面活性剂水溶液产生的泡沫，是因为表面活性剂定向排列形成双电层，借助排斥作用阻碍泡沫合并而使泡沫稳定。这种性质的泡沫，只需向体系中加入一种

46、离子电荷相反的表面活性剂，甚至本身也是助泡剂，就可降低泡沫稳定性。这是因为两种表面活性剂彼此干扰，妨碍在气液界面上定向排列，破坏了膜弹性，因而产生消泡作用。,C、消泡剂能促使液膜排液，因而导致气泡破灭,泡沫液厚泡沫弹性好，自愈效应强；泡膜排液速率反映泡沫的稳定性。起泡体系的粘度越高，排液速度越低，如蛋白质溶液，肽链之间能够形成氢键；有些表面活性剂能与水分子形成氢键，能减少泡沫中的排液，起到稳泡作用。加入不产生氢键的表面活性剂，取代产生氢键的表面活性剂，就可以使排液加快。,d 表面活性剂吸附层与泡膜上两吸附层当中的泡膜液之间亲和力的强弱； 表面活性剂的HLB值反映这种亲和性，高HLB的表面活性剂

47、，亲水性强，易于使吸附层之间的水随着迁移，是稳泡剂；低HLB值的表面活性剂，亲水性弱，不易使吸附层之间的水随着迁移，往往是消泡剂。 亲水性弱的低HLB值的表面活性剂取代了亲水性强的高HLB值的表面活性剂，能使泡膜吸附层之间的水不随吸附层迁移，从而促进泡膜排液，起到消泡作用,破泡剂与抑泡剂的区别,（1）消泡剂可分为破泡剂和抑泡剂,破泡剂：是加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂。如低级醇、天然油脂。一般来说，破泡剂都是其分子的亲液端与起泡液亲和性较强，在起泡液中分散较快的物质。这类消泡剂随着时间的延续，迅速降低效率，并且当温度上升时，因溶解度增加，消泡效率会下降。 抑泡剂：是发泡前预先添加而阻止

48、发泡的添加剂。聚醚及有机硅等属于抑泡剂。一般是分子与气泡液亲和性很弱的难溶或不溶的液体,（2）作用机理上的区别,破泡剂的破泡机理大致有二种。 第一，吸附助泡剂，加入电解质，瓦解双电层，及使助泡物被增溶等机理，这样就破坏助泡物的稳泡作用。在这些过程中消泡剂发挥一次消泡作用就被消耗。同时消耗掉相应的助泡物。 第二，低级醇等溶解性较大的消泡剂，加到气泡液中局部降低表面张力，发挥破泡作用，同时本身不断破为碎块，陆续溶解而失去破泡作用。破泡过程中，破泡剂不断失效、消耗，而助泡剂却不受影响,抑泡机理：一般认为抑泡剂分子在气液界面上优先被吸附，它比助泡剂的表面活性更强，更易吸附到泡膜上，但是由于本身不赋予泡膜弹性，所以不具备稳泡作用。这样当液体中产生泡沫时，抑泡剂首先占据泡膜，抑制了助泡剂的作用，抑制了气泡。,（3）破泡剂与抑泡剂的相互关系溶解度大的破泡剂，消泡作用只发挥一次；溶解度小的破泡剂，消泡作用可持续一段时间。如果溶解度进一步降低，即成为抑泡剂。另一方面，破泡剂大量使用，比有抑泡作用，抑泡剂大量使用也比有破泡作用。,1）消泡剂选用依据： 表面活性剂，具有较低的表面张力（内聚力弱），消泡效果明显。 对气-液界面的散布系数必须足够大，才能迅速消泡； 无毒害性，且不影响发酵菌体；不会在使用、运输中引起任何危害； 不干扰各种测量仪表的使用； 在水中的溶解度较小，以保持持久的消泡性能；,