SN T 1145-2014 苜蓿黄萎病菌检疫鉴定方法.pdf

《SN T 1145-2014 苜蓿黄萎病菌检疫鉴定方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN T 1145-2014 苜蓿黄萎病菌检疫鉴定方法.pdf（40页珍藏版）》请在麦多课文档分享上搜索。

1、出入检验栓疫行标?SN/1145-2014 代替SNjT1145-2002 定方法Detection and identification of Verticilliumlbo-atrum Reinl回&Berthold 2014-04-09发布2014-11-01实施中半人员共和匾发布自家后竟量监督检雄栓瘟总局SNj1145-2014 目。吕本标准按照GBjTl.1-2009给出的规则起草。本标准代替SNjT1145一2002(植物检疫茵宿黄萎病菌检疫鉴定方法，与SN/T1145-2002相比，除编辑性修改外主要技术变化如下:一增加了分子生物学及蛋白质谱检测内容;一一增加了附录C、附录D、附

2、录E、附录F。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究皖、中国检验检疫科学研究院。本标准起草人:章桂明、王颖、程颖慧、汪莹、王伍、吴品珊、杜洪忠。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一一-SN/T1145-2002。1 高宿黄萎病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了茵宿黄萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于茵宿黄萎病菌的寄主携带茵宿黄妻病菌的检疫鉴定。2 定义和术语2.1 轮状分生于包子梗verticillate 轮枝菌的分生抱子梗类型，5

3、轮。2.2 2.3 2.4 厚t亘于包子chlamydospore 微菌核microscleI悦ium暗褐色或黑色近球形坚硬休眠茵丝体resting 休眠体，暗褐色或黑色，3 基本信息中文名:首稽黄萎病菌学名:Verticillium albo-atrum Reinke &. Berthold SN/T门45-2014分类地位:真菌界(Fungi)，元性型真菌(Anamorphicfungi)，丝J包纲(Hyphomycetes) ，丝抱目(Hyphomycetales) ，丛梗抱科(Moniliacea时，轮枝抱属(Verticillium)。传播途径:茵宿黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤

4、、病残体、风、灌溉水和昆虫传病。近似种:大丽轮枝菌Verticilliumdahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens ，云状轮枝菌V.nubilum、三体轮枝菌V.tricor户削。4 方法原理该病菌的为害症状、形态学特征、分子生物学特征及蛋白质谱特征是鉴定该病菌的依据。SN/T 1145-2014 5 仪器及用具5.1 仪器烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、光照培养箱、天平(感量1/100g、1/10000 g)、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作台、普通PCR仪、凝腋成像仪、实时荧光PCR仪、基质辅助激光

5、解析电离飞行时间质谱仪、超声波振荡仪。5.2 用具培养皿、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、慑子、研钵、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、微量移液器(0.5L，2L，10L，20L，100f1-L，200L，1000L)、PCR反应管(0.2mL, 0.5 mL)、Tip头(0.1L10L，5L200L， 100Ll 000L)、质谱分析样品靶。6 试剂和培养基6.1 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。2%3%次氯酸铀溶液、无水乙醇、75%乙醇、无菌去离子水、2，4D饷盐、CTAB提取缓冲液、Tris饱和盼、三氯甲烧、异戊醇、异丙醇、RNaseA、液氮、PCR试剂(包括

6、TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgC12)、DNAMarker、澳化乙钝、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、丁qMan Master Mix、特异性引物和探针、乙腊、三氟乙酸(TFA)、甲醇、氨基今起基肉桂酸(日CCA)、质谱校正标准液(肤标准品及蛋白标准品)。6.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、梅干煎汁酵母琼脂培养基(PLYA)、马铃薯葡萄糖液体培养基，参见附录A。7 抽样与现场检查7.1 茵宿种子的抽样按以下标准抽样:1. 5 kg 10 kg取l份;11 kg 100 kg取2份;101 kg500 kg取3份;501 kg 1 000 kg取4份。每份样品为1.5kg o

7、 1. 5 kg以下全部取样。7.2 茵宿种苗、植株的抽样按以下标准抽样:50株以下取1份;51株200株取2份;201株1000株取3份;1 001株5 000株取4份;5 001株以上每增加5000株增取1份，不足5000株的按5000株计。每份样品5株。7.3 现场检查百稽种子抽样时注意检查种子中有无可疑带病种子、茵宿残体;植株抽样时注意检查有无可疑病株。如有可疑病种、病株应将其挑出来，送实验室作进一步检验鉴定。SN/T 1145-2014 8 制样按7.1的要求抽取的每份样品应充分混匀，制成平均样品，从每份平均样品中取25g做检验样品。9 检疫鉴定9.1 形态学方法9. 1. 1 种子

8、保温培养9. 1.1. 1 眼水纸培养血的准备用0.2%的2，4户D铀盐溶液浸渍无菌吸水纸(滤纸)，再将吸水纸铺在9cm直径的巳灭菌的培养皿底部，每皿铺3层。9. 1.1. 2 样品种子的放置将抽取的检验样品不经表面消毒直接放置于培养血中，每皿均匀放置25粒种子。9. 1.1.3 培养将培养皿置于21oc 23 oc条件下培养，每昼夜用黑光灯照明12h，培养10d。9.1. 1. 4 竟检10 d后取出培养皿，用体式显微镜逐粒检查种子，根据轮枝状分生于包子梗和分生于包子的着生情况，检出带菌种子，见附录B。9.1. 1. 5 选择性培养从带菌种子上挑取抱子接种到梅干煎汁酵母琼脂培养基CPLYA)

9、和马铃薯琼脂培养基CPDA)中进一步培养，20d后检查培养结果。9. 1.1. 6 致病性测定9. 1. 1.6. 1 接种方法采用浸根法接种，即从培养2周的病菌培养基上刮下分生于包子配制成100个面子/mL的悬浮液，取在无病条件下栽培4周龄长出3片4片真叶的百宿幼苗，清洗掉根部土壤并用刀片切去主根根尖1 cm2 cm后，立即在抱子悬浮液中浸根5min，然后栽入营养钵中，在22oc 25 oc和每天光照14 h15 h下培育。9. 1. 1. 6.2 症状检查接种l周后，植株开始表现症状，进行症状检查。9. 1. 1.6.3 病原菌再分离及鉴定取小块病健交接处组织，用2%3%次氯酸铀溶液消毒3

10、min，用无菌水冲洗3次，置于PDA培养基上22oC24 oC进行分离培养，10d后观察菌落性状和病原菌特征。3 SN/T 1145-2014 9.1.2 种苗、植株的检验9.1.2.1 症状检查用肉眼查看种苗、植株样品，根据茵宿黄萎病的症状挑选出怀疑发病的植株，带入实验室作进一步检验。9.1.2.2 保湿培养取待检样品的茎或叶柄切成lcm长的小段，用自来水冲洗掉表面的泥土杂物后，用含2%3%次氨酸饷溶液消毒1min2 min，无菌水冲洗3次后，用灭菌解剖刀横切成1mm4 mm的小片，并放置在温皿内滤纸上，每皿5片lO片9.1.2.3 号竟检用实体显微镜观察有无产生病探菌子实体手现察维生于包子

11、、梗的基部颜色以及是否形成休眠结构。9. 1. 2.4 按照9.1.1.5和9.1.1.69.2 分子生物学鉴定9.2.1 DNA提取病菌基因组DNA提取方法见9.2.2 PCR检i则定性PCR检测和实时荧光9.3 蛋白质i普鉴定9.3.1 样品制备制备用于基质辅助激光解析F.L 9.3.2 质谱检测MALDI TOF MS检测方法见F.2。10 鉴定特征10.1 症状MS)的样品的方法见附录F中接种7d后，植株开始发病，中叶自下而上变黄和萎焉。下部小叶多呈斑块状黄色，上部黄化中叶叶脉仍可保持绿色，严重时叶片枯死脱落。重病植株矮化，茎忏细弱，倒伏，整株枯萎死亡。10.2 病原菌形态特征10.2

12、.1 PDA上的培养性状病原菌在PDA培养基上生长很快，最初形成的菌落无色，2周3周后因产生了休眠菌丝而变成4 SN/T门45-2014灰褐色至黑褐色;不芽殖形成类倒微菌核状的结构，不产生厚垣子包子和微菌核;产生的分生于包子梗多，直立，元色，分生抱子梗基部暗色、膨大，或元色、无明显膨大，土生有1层5层瓶状小梗，每层的瓶体小梗数1个5个，可轮生、对生或互生，常见分生于包子梗二次分枝，瓶状小梗大小为20m30m(50m) X 0.4m3.2m) ;分生于包子着生于瓶状小梗的端部，椭圆形或圆桶形，透明，多为单胞，少数有一个隔，大小为3.5m10.5m(12.5m)X(2m4m)。见附录B。病菌生长适

13、温为20 oC23 oC。10.2.2 PLYA上的培养性状病原菌在PLYA上培养时，在24oC 26 oC条件下，菌落呈辐射状扩展，培养20d可产生休眼菌丝体。10.3 茵蓓黄萎病菌与其近似种的苗桔黄萎病的近似种主要大大，呈节结状，菌丝直径2.8mV.dahliae产生黑色微菌核，05m178m) X 08.9 V.nigresce川产生黑褐V.nubilum产生黑褐色厚V.tricorus产生休眠菌丝、径3.2m7.1m。微菌34m80m。10.4 PCR特异性在阳性对照、阴性对照和空白物片段大小为330bp，实时荧光10.5 质谱检测将获得的目标物的质谱分析图计算得到相应的匹配分值。11

14、 结果判定11.1 形态学结果V.igresce川、云状轮枝菌的主要区别为:子。休日民菌丝多于包、隔膜间隔膨，各细胞膨大，呈念珠状，直细胞构成，长形至近球形，直径的定性PCR特异性扩增产比对，通过Biotype软件如果分离物的形态特征与10.2描述的病原菌形态特征相吻合，通过致病性测定所获得的症状特征也与10.1所描述的症状柏吻合，再分离获得的培养物的形态特征也仍与10.2描述的病原菌形态特征相吻合，可确定为茵稽黄萎病菌。11.2 分子生物学检测结果11. 2.1 定性PCR检测在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生约330峙的预期大小条带的情SN/T门452014况下:如果检

15、测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性;如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带，则为阴性。11.2.2 实时荧光PCR检测在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则:一检测Ct值小于或等于36，判定为首稽黄萎病菌;一一检测Ct值大于或等于40，判定为非盲宿黄萎病菌;十一检测Ct值在3640之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上;如果检测Ct值仍在3640之间，则应按照形态学方法进行鉴定。11. 3 蛋白质谱检测将获得的质谱分析图谱与已有的吉稽黄萎病菌的标准图谱进行比对，通过Biotype软件计算得到匹配分值，分值的

16、范围为2.33.0的，判定为首宿黄萎病菌;如果分值的范围为2.02.3的，则应按照形态学方法进行鉴定;分值2.0以下，判定为非酋宿黄萎病菌。12 样品保存与处理保存样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现吉稽黄萎病菌，该样品应保存1年，以备复验。保存期满后，应经灭菌处理。13 菌种保存与处理分离到的茵稽黄萎病菌菌种，转入PDA斜面培养基上，置于5C黑暗条件下保存，并定期转管，标注分离物来源、寄主、分离时间、鉴定人。14 实验记录保存妥善保存检验报告包括症状、病菌等图文资料。检验报告应注明检验日期、方法、结果等，并有检验人签名。6 共和粮液相撞撞瞌标;SN/0683-2014

17、 代替SN0683-1997 五环日坐残留量的测定谱明质谱/康i普?Determination of tricyclazole in cereals for export HPLC-MS/MS method 2014-01-13发布2014-08-01实施中华白人员共和曾发布国家贯主重监督栓验检疫感中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口粮谷中三环瞠残留量的测定液相色谱-质谱/J贡谱法SN/T 0683-2014 ;-中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区主里河北街16号(100045)总编室，(010)68533533网址WWW.spc.口中国标准出版社秦

18、皇岛印刷厂印刷-x-开本880X 1230 1/16 印张1.25字数32千字2014年12月第一版2014年12月第一次印刷印数1-1300 争夺书号，155066 2-28081 定价21.00元SN/T 0683-2014 目。吕本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准代替SN0683-1997(出口根谷中兰环瞠残留量检验方法。与SN0683-1997相比，本标准技术变化如下:前处理方法由原先的人工填料层析柱净化改为国相萃取柱净化法;仪器方法由原先的气相色谱-氮磷检测器法和气相色谱一质谱方法确证，改为高效液相色谱一质谱/质谱法;一一检测基质范围由原来的稻谷扩充为玉米、大麦、

19、糙米、大米、小麦。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国西藏出入境检验检疫局。本标准主要起草人:周瑶、王君、次仁拉珍、曹晨、曹晓钢、由栗、郭德华、朱坚。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一-SN0683-1997。I SN/0683-2014 出口粮谷中三环瞠残留量的测定液丰目色i普阳质谱/贡谱法1 范围本标准规定了出口粮谷中三环瞠残留量的测定方法。本标准适用于玉米、大麦、糙米r-，r伫黯矿W柿子SN/T 0800.1 证2 规范性引用文件

20、件。凡是不注日期的引用文件，3 原理测定，外标法定量。，供液相色谱质谱/质谱仪4 试剂和材料除另有规定外，试剂均为4.1 丙酣:色谱纯。4.2 二氯甲炕:色谱纯。4.3 甲醇:色谱纯。4.4 乙睛:色谱纯04.5 甲酸:色谱纯。4.6 醋酸镀:色谱纯。4.7 5 mmol/L醋酸镀水溶液(含有0.1%甲酸):称取0.385g醋酸镜，加入1L水溶解后，加入1mL 甲酸混匀。4.8 二氯甲:皖-甲醇q容液(99十1，体积比)。4.9 乙腊-水降液(1十1，体积比)。4.10 乙腊5mmol/L醋酸镀水溶液(含有0.1%甲酸)0+1，体积比)。4.11 标准品:兰环瞠(Tricyclazole，CA

21、SNo. 41814-782) ，纯度二三99%。4.12 标准储备液:称取适量三环瞠标准品，用乙睛配制成为10g/mL的标准储备液，0oC4 oC保存，有效期12个月。用乙腊-5mmol/L醋酸锻水珞液(含有0.1%甲酸)(1十1，体积比)配置所需标准中间液和标准工作液。4.13 中性氧化铝固相萃取柱:1 g/3 mL。4.14 注射器和0.22m有机相针式过滤器。1 SN/T 0683-2014 5 仪器和设备5.1 粉碎机或相当的设备。5.2 液相色谱串联质谱仪，配有电嗤雾离子源。5.3 均质器。5.4 涡旋振荡器。5.5 离心机:5 000 r/min。5.6 分析天平:感量0.1mg

22、 ,O.OOl g。5.7 固相萃取装置。5.8 50 mL离心管。5.9 10 mL容量瓶。6 式样制备与保存制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。将样品按SN/T0800.1的规定缩分至1地，全部磨碎并通过1 mm圆孔筛，均分成两份试样，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于5 oc以下避光存放。7 分析步骤7.1 提取称取1g样品(准确至0.001g)于50mL离心管中，加入5mL丙酬，用涡旋振荡器充分振荡提取5 min，在4100 r/min转速下离心4min后，将上清液倒入小试管中。重复上述步骤残渣再用5mL丙酬提取一次。合并两次提取的上清液于10mL容量瓶中，用丙自

23、由定容。视样品中三环瞠含量高低，取1 mL10 mL提取液于350C水浴中氮吹至干，再准确加入4mL二氧甲皖溶液充分振荡溶解、强匀。7.2 净化在重力流速下，用6mL二氯甲:院活化中性氧化铝固相萃取柱，然后将2.0mL上述提取液过柱，再用6mL二氯甲:皖溶液淋洗，最后用8mL二氯甲:院甲醇恪液(99十1，体积比)洗脱，将所收集的洗脱液于35oC水浴中氮吹至干，残余物用2.0mL乙腊5mmol/L醋酸镀水溶液(含有0.1%甲酸)(1十1，体积比)定容，混匀后过0.22m有机相针式滤膜供液相色谱串联质谱仪检测。7.3 测定7.3.1 高效液中目j贡谱条件高效i夜相质谱条件如下:a) 色谱柱:C18

24、柱，长50mm，内径2.1mm，粒径3.0m或相当者;b) 流动相:A:5mmol/L醋酸锁水溶液(含有0.1%甲酸)，B:乙脯溶液;流速:0.3mL/min，梯度洗脱参数见附录A表A.1; c) 柱温:30 oC; d) 进样量:10L;e) 质i普参数条件参见附录A。2 SN/T 0683-2014 7.3.2 定量测定根据试样中被测物的药物含量，选取响应值相近的标准工作液进行分析。标准工作液和待测液中药物的响应值均应在仪器线性响应在围内。如果含量超过标准曲线范围，应用2.0mL乙腊5mmol/L 醋酸锻水溶液(含有0.1%甲酸)(1十1，体积比)稀释到合适浓度后分析。在上述色谱条件下的三

25、环嗖的参考保留时间为7.3min，标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B中图B.1。7.3.3 定性测定按照液相色谱质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表l规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%允许的相对偏差/%8 空白试验50 士20除不称取试样外，均按上述操作步骤进行。9 结果计算和表述2050 1020 士25士30三二10土50用色谱数据处理机或按式(1)计算

26、样品中待测药物残留量，报告结果时以样品中可提取的三环瞠残留量报告结果，计算结果需扣除空白值。式中:X =. c XA , xV -A X m X 1 000 X 样品中待测组分残留量，单位为微克每千克(g/kg); c 一一标准工作溶液中药物的浓度，单位为纳克每毫升(口g/mL); 人一一标准工作溶液中药物的峰面积;V 样品珞液最终定容体积，单位为毫升(mL); A 一一一样液中药物的峰面积;m 最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。10 测定低限、回收率10.1 测定低限本方法测定低限为20.0g/kg。10.2 回收率添加回收率实验数据参见附录C中表C.1。. ( 1 ) 3 SN/T

27、0683-2014 附录A(资料性附录)Agilent 641 OB液相色谱-四级杆质谱/质谱仪参数1)A.1 梯度洗脱程序表见表A.l。梯度时间/min4 13 13.1 15 A.2 质谱/质谱仪参数质谱/质谱仪参数如下:a) 离子源:ESI，正离子;b) 雾化气:氮气;c) 气流速CGasFlow) : d) 干燥气温度:350 OC; 巳)雾化气CNebulizer): f) 电子倍增器电压(g) 扫描方式:正离子扫描;h) 毛细管电压:4000V; i) 检测方式:多反应监测CMRM)参数见表A.2o表A.2多反应监测参数表组分名称定性肖子对定量离子对去簇电压/(m/z) (m/z)

28、 V 190163 三环I些190 163 80 190 136 一流动相B/%2 99 99 2 2 碰撞能量/色i普保留时间V tJmin 25 7.3 30 1) 非商业性声明:附录A所列参数是在Agilent6410B质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。4 附录B(资料性附录)三环哇标准品多反应监测(MRM)色i普图1. 1. 2 . . 1111 . AUAU1 mm sieve , and divide into 2 equal portions. Keep the sample into a clean

29、vessel , seal and label.丁hetest sample is stored below - 5 c and kept away from light. 7 T est procedu res 7.1 Extraction Weigh 1 9 (0.001 g) sample in a 50 mL centrifuge tube ,add 5 mL acetone (4.1) , homogenize them by vortex mixer for 5 min. The mixture was centrifuged at 4 400 r/min for 4 min. P

30、our the supernatant into a tube.Repeat the procedures before.Combine the supernatant in the volumetric flask and dilute to the mark with acetone.According to the concentration level of tricyclazole in sample ,take 1 mL 10 mL extract to be dried by N2 in 35 c water bath.Dilute the residue with 4 mL d

31、ichloromethane and mix them thoroughly. 7.2 Clean up Activate the N-Alumina SPE column with 6 mL dichloromethane,and then load 2.0 mL extract on the column.Wash the column with 6 mL dichloromethane,and then use 8 mL dichloromethane- methanol (99十1, V / V) to elute the analyte. Drthe eluate by N2 in

32、35 c water bath and reconstitute the analyte in 2.0 mL acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate (1 + 1, V/V).Mix them thoroughly for further HPLC-MS/MS analysis. 7.3 Determination 7.3.1 HPLC operating conditions HPLC operating conditions are as following: a) Column: C18 ,50 mm x 2.1 mm( i. d.) ，3m，or

33、the equivalent. b) Mobile phase: A: 5 mmol/L Ammonium Acetate-O. 1 % formic acid，也Acetonitrile.Flow rate: 0.3 mL/min. The gradient program is listed in the丁ableA. 1 of Annex A. c) Column temperature:30 c. 10 SN/0683-2014 d) Injection volume: 10L e) Mass parameters are listed in the Annex A. 7.3.2 Qu

34、antification of HPLC-MS/MS According to the above HPLC-MS/MS operating condition , determine the sample solution and the standard working solution simultaneously. The responses of the analte in the standard working solution and the sample solution shall be within the linear range of the instrument d

35、etection.Quantified by external standard. Under the above HPLC-MS/MS operating condition , the retention time of tricclazole is 7.3 min. The MRM chromatograms of the standards are presented in the Annex B. 7.3.3 Confirmation of HPLC-MS/MS Determine the sample under the established LC/MS-MS condition

36、s , and calculate the intensity ratio of two selected ion pairs of the sample solution and the standard working solutions.lf the retention time of sample chromatogram peak are consistent with that of working solution , and the relative abundance ratio tolerance meets the requirements listed in the T

37、able 1, it can be concluded that this compound does exist in the sample. 丁able1 Maximum permitted tolerances for relative ion intensities while conformation Relative ion intensities/% 50 2050 1020 三二10Permitted relative tolerances/% 士20士25士30士508 Blank test 丁heoperation of the blank test is the same

38、 as the described in the method of determination , but without addition of the sample. 9 Calculation and expression of result Calculate the content of benzodiazepine residues in the test sample bHPLC-MS/MS data processor or according to the formula (1). The blank value should be subtracted from the

39、above result of calcu lation. x = c x As x V -A x m x 1 000 . ( 1 ) 11 SN/0683-2014 Where: X -the residue content in the test sample，用/kg;c -the concentration in standard working solution , ng/mL; As一thepeak area of residue in standard working solution; V -the final volume of the sample solution , m

40、L; A一-thepeak area of residue in sample solution; m -mass of test sample of final sample solution , g. 10 Limit of quantitation 10.1 Li mit of quantification 10.2 Recovery According to the experimental the Table C.1 of Annex C. 12 each fortifying level is listed in Annex A (Informative annex) Main M

41、ass Parameters of Agilent 641081) A. 1 Gradient program of mobile phase See table A. 1. Table Time/min 4 A.2 MS/MS parameters MS/MS parameters see the foll a) lon Source: ESI , Positive; b) Nebulizer gas: N2 ; c) Gas Flow:10 L/min; d) lon source temperature: 350 oc ; e) Nebulizer:275.8 kPa(40 psi);

42、f) Delta EMV:400 V; g) Scan mode: Positive; h) Electro spracapillarvoltage: 4 000 V; SN/0683-2014 Mobile phase B/% 2 99 99 2 2 1) Non-commercial statement: the equipments and their types involved in the standard method are not related to com mercial aims , and it is encouraged to use equipments of d

43、ifferent corporation or different type. 13 SN/T 0683-2014 i) Monitor mode: Multiple reaction monitoringCMRM) Cseeing table A. 2). Table A. 2 Related parameters and qualifier and quantifier in MRM Transitions for Transition for Compound Cone Voltage/ Collision energy/ Retention time/ qualification qu

44、antification V V 口1Jnna汀1eCm/z) Cm/z) 190 163 25 Tricyclazole 190-163 80 7.3 190 136 30 14 Annex B C Informative annex) Selected ion chromatograms of tricyclazole CMRM) x 1021 +TJC MRM(树料)8.d*7.3 4 3.5 3 2.5 2 1. 5 0.5 11 X102 +MRM(190.000 00-136.000 00)8.d 7.3 2 1. 8 1. 6 1. 4 1. 2 0.8 0.6 0.4 X 10

45、2 +MRM (190. 000 00- 163.0口000)8.d7.3 2.2 2 1. 8 1. 6 1. 4 1. 2 1 0.8 0.6 0.4 5. 5 6 6:ji 1 . . .z:. 5 _ 8: 5 9 Counts vs.Acquisiton Time(min) Figure 8.1 Selected ion chromatograms of tricclazole (MRM) SN/T 0683-2014 立ON|们OHZ的SN/0683-2014 Annex C (Informative annex) The recovery ranges of tricyclazo

46、le residue Matrix Fortified level/ (mg/kgl Recovery range/% 0.02 78. 1 93. 7 Corn 1.00 80. 391. 2 3.00 79. 690. 0 0.02 80. 895. 6 Barley 1.00 85. 495. 4 3.00 85. 794. 1 0.02 80. 694. 1 Brown Rice 1.00 82. 1 97. 3 3.00 84. 396. 6 0.02 73. 086. 1 Wheat 1.00 80.291.3 3.00 81. 590. 2 0.02 73. 1 87. 6 Ri

47、ce 1.00 80. 590. 4 3.00 83. 888. 7 丁ableC. 1 侵权必究版权专有兴书号:155066 2-28081 定价:21.00元SN/T 0683一2014SN/T 1145-2014 附录A(资料性附录)分离培养轮枝菌的几种培养基的配制方法A.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)马铃薯200g，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸30min，过滤去渣，加水补足1000 mL，再加10 g20 g葡萄糖和17g20 g琼脂，加热使洛化，趁热过滤，分装灭菌。A.2 梅干煎汁酵母琼瞄培养基(PLYA)取梅干50g切成小片，在100mL水中煮沸30min，将梅干榨汁

48、后去渣，调节pH至5.86.0，加1 g酵母浸膏，5g乳糖，30g琼脂，900mL蒸锚水，加热使溶化，趁热过滤，分装灭菌。A.3 马铃薯葡萄糖液体培养基马铃薯200g，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸30min，过滤去渣，加水补足1000 mL，再加10 g20 g葡萄糖，加热使洛化，分装灭菌。7 SN/T门45-2014附录B(规范性附录)茵宿黄萎病菌形态特征图2 说明I 暗色菌丝体;2、3暗色菌丝体的萌发;4 分生抱子梗及分生于包子;5 一一成熟的分生于包子;6 一一一初期的分生抱子梗;8 10 分生袍子的萌发后期。注:仿Reinke&. Berthold , 18790 8 SN/T门45-2014附录C(规范性附录)基因组DNA提取方法C.1 培养物核酸的制备收集分离培养得到的菌丝，于研钵中液氮冷冻后研磨，采用CTAB法提取病原菌总DNA。具体方法如下:称取液氮研磨处理过的一-弃上清液，加入70%乙醇淀，用冷冻干燥仪进行干一20oc冰箱中保存。该核酸制备也可采用试剂盒法。C. 2 DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定DNA纯度和浓度，计算公式如下:PCR级DNA榕液的OD26030 m巾，期间不断混匀;口m处的吸收值，计算核酸的9 SN/T 1145一2014D.1 引物序列附录D(规范性