ISO 6461-1-1986 Water quality Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia) Part 1 Method by enrichment in a liquid medium《.pdf

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1、Norme internationale INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION.MEX)(CIYHAPOHAR OPTAHM3AL CDU 543.39: 579.852.13 Rf. no : ISO 6461/1-1986 (FI Descripteurs : eau, qualit, essai, analyse microbiologique, dtermination, microorganisme, bactrie sulfito-rductrice. Prix bas sur 3 pages Avant-propos LIS

2、O (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de IISO). Llaboration des Normes internationales est confie aux comits techniques de IISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit te

3、chnique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne- mentales, en liaison avec IISO participent galement aux travaux. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour approbation, avant leur acceptation c

4、omme Normes inter- nationales par le Conseil de IISO. Les Normes internationales sont apbrouves confor- mment aux procdures de IISO qui requirent lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. La Norme internationale ISO 6461 /l a t labore par le comit technique ISO/TC 147, Qualit de leau

5、. Lattention des utilisateurs est attire sur le fait que toutes les Normes internationales sont de temps en temps soumises rvision et que toute rfrence faite une autre Norme internationale dans le prsent document implique quil sagit, sauf indication contraire, de la dernire dition. 0 Organisation in

6、ternationale de normalisation, 1986 Imprim en Suisse NORME INTERNATIONALE ISO 6461/1-1986 (F) Qualit de leau - Recherche et dnombrement des spores de micro-organismes anarobies sulfito-rducteurs (clostridia) - Partie 1 : Mthode par enrichissement dans un milieu liquide 0 Introduction Les spores de m

7、icro-organismes anarobies sulfito-rducteurs (clostridia) sont largement rpandues dans lenvironnement. Elles sont prsentes dans les matires fcales humaines et ani- males, ainsi que dans les eaux uses et le sol. la diffrence des Escherichia Co/i et des autres organismes coliformes, les spores surviven

8、t dans leau pendant longtemps, car elles sont plus rsistantes que les formes vgtatives laction des fac- teurs chimiques et physiques. Elles peuvent ainsi fournir des indications sur une pollution loigne ou intermittente. Elles peuvent mme tre rsistantes la chloration dans les propor- tions habituell

9、ement utilises pour le traitement des eaux, et sont donc ainsi utiles pour les besoins des contrles. ISO 6461 comprend les parties suivantes: Partie 1 : Mthode par enrichissement dans un milieu liquide. Partie 2: Mthode par filtration sur membrane. 1 Objet La prsente partie de IISO 6461 spcifie une

10、mthode pour la recherche et le dnombrement des spores de micro-organismes anarobies sulfito-rducteurs (clostridia) par enrichissement dans un milieu liquide. 2 Domaine dapplication Le principe de la mthode est applicable tous les types deau, y compris les eaux troubles. 3 Rfrences ISO 3696, Eau usag

11、e de laboratoire - Spcifications. ISO 5667, Qualit de leau - chantillonnage - Partie 2: Guide gnral sur les techniques dchantiflon- nage. Partie 3 : Guide gnral pour la conservation et la manipula- tion des chan tilfons. ISO 8199, Qualit de leau - Directives gnrales pour lanalyse microbiologique par

12、 dnombrement des micro- organismes sur milieu de culture. ) 4 Dfinition Dans le cadre de la prsente partie de IISO 6461, la dfinition suivante est applicable. clostridia : Micro-organismes anarobies formant des spores et sulfito-rducteurs, appartenant la famille des Bacillaces et au genre Clostridiu

13、m. 5 Principe La recherche des spores dorganismes anarobies sulfito- rducteurs (clostridia) dans un chantillon deau de volume dtermin, passe par les tapes suivantes. 5.1 Slection des spores Slection des spores dans lchantillon, par chauffage pendant une priode de temps suffisante pour que les bactri

14、es vgta- tives soient dtruites. 5.2 Culture par enrichissement Recherche et numration des spores des organismes anaro- bies sulfito-rducteurs par inoculation de volumes de lchantil- lon dans les milieux liquides denrichissement, suivie de Iincu- bation 37 + 1 OC pendant 44 + 4 h dans des conditions

15、anarobies. 6 Milieux de culture et ractifs 6.1 Principaux matriaux Pour amliorer la reproductibilit des rsultats, il est recom- mand dutiliser, pour la prparation des diluants et des milieux de culture, des composants de base dshydrats ou des milieux complets dshydrats. De la mme facon, des prparati

16、ons commerciales de ractifs peuvent tre utilises. Les prescrip- tions du fabricant doivent tre suivies scrupuleusement. 1) Actuellement au stade de projet. SO 6461/1-1986 (FI 6.2.2.2 Milieu de base double concentration Leau utilise doit tre de leau distille ou dminralise, exempte de substances susce

17、ptibles dinhiber la croissance des micro-organismes dans les conditions de lessai (voir ISO 3696). Les mesures du pH doivent tre effectues au pH-mtre, et rap- portes la temprature de 25 OC. Si les milieux de culture prpars ne sont pas utiliss extempo- ranment, ils doivent, sauf spcification contrair

18、e, tre conser- vs lobscurit environ 4 OC pendant 1 mois au maximum. 6.2 Milieux de culture et diluant 6.2.1 Diluant Utiliser un des diluants indiqus dans IISO 8199. 6.2.2 Milieu renforc spcial pour les clostridia (DRCM) Prparer le milieu de base double concentration comme en 6.2.2.1, mais rduire le

19、volume deau distill de moiti. Transvaser des aliquotes, respectivement, de 10 ml et de 50 ml du milieu, dans des flacons avec bouchons vis, de capacits respectivement de 25 ml et 100 ml. Striliser lautoclave 121 + 1 OC pendant 15 min. 6.2.3 Sulfite de sodium (Na2S03), solution 4 % (mlm). Dissoudre 4

20、 g de sulfite de sodium anhydre dans 100 ml deau. Striliser par filtration. Conserver entre 2 et 5 OC. II est conseill de prparer une nouvelle solution tous les 14 jours. 6.2.4 Citrate de fer(lll) KsH507Fe), solution 7 % (mlm). Dissoudre 7 g de citrate de fer(lll) dans 100 ml deau. Striliser par fil

21、tration. Conserver entre 2 et 5 OC. 6.2.2.1 Milieu de base simple concentration Composition Viande digre dans la peptone tryptique 1og Extrait de viande 10 g Extrait de levure 1,5 9 Amidon lg Actate de sodium hydrat 5g Glucose l!3 Chlorhydrate de L-cystine 0,5 g Eau 1000 ml Prparation Mlanger la pep

22、tone, lextrait de viande, lactate de sodium ainsi que lextrait de levure 800 ml deau. Avec les 200 ml deau distille qui restent, prparer une solution damidon comme suit: mlanger lamidon avec un peu deau froide de manire faire une pte. Chauffer le reste de leau jusqu ce quelle commence bouillir et li

23、ntroduire lentement dans la pte, tout en agitant constamment. Ajouter alors cette solution damidon au premier mlange et chauffer jusqu ce que le point dbullition soit atteint et que le mlange se dissolve. A la fin, soudre. ajouter le glucose et le chlorhydrate de L-cystine; dis- Ajuster le pH en le

24、faisant passer de 7,l 7,2 avec une solution dhydroxyde de sodium 1 mol/l. II est conseill de prparer une nouvelle solution tous les 14 jours. 6.2.5 Milieu complet 6.2.5.1 Le jour de lanalyse, mlanger des volumes gaux des solutions de sulfite de sodium (6.2.3) et de citrate de fer(lll) (6.2.4). 6.2.5

25、.2 Ajouter 0,5 ml du mlange (6.2.5.1) dans chaque fla- con de milieu de concentration simple (6.2.2.1) qui vient dtre chauff er refroidi. 6.2.5.3 Ajouter 0,4 ml du mlange (6.2.5.1) chaque volume de 10 ml et 2 ml du mlange chaque volume de 50 ml du milieu double concentration, ces volumes tant traits

26、 de manire semblable. 7 Appareillage et verrerie de laboratoire Verrerie et matriel la bactriologie, et de laboratoire couramment employs pour 7.1 Flacons ou fioles avec bouchons vis, en verre ou borosilicat, de capacits 200; 100 et 25 ml. 7.2 Pipettes volumtriques, de capacits 10 et 1 ml. 7.3 Bains

27、 deau, contrls thermiquement. 7.4 Tubes essai, de 150 mm x 13 mm. 2 ISO 646111-1986 (FI 7.5 Fil de fer. 7.6 Incubateurs, rglables 37 + 1 OC. 8 chantillonnage Se rfrer IISO 5667/2 et IISO 8199 en ce qui concerne les techniques dchantillonnage. 9 Mode opratoire 9.1 Traitement des chantillons Se rfrer

28、IISO 5667/3 et IISO 8199 en ce qui concerne la mthode suivre pour la conservation et le traitement des chantillons. 9.2 Slection des spores (technique) Avant quil soit procd lessai, lchantillon deau doit tre chauff dans un bain deau 75 + 5 OC pendant 15 min par- tir du moment o cette temprature a t

29、atteinte. Un flacon similaire contenant le mme volume deau que celui de Ichan- tillon pour essai doit tre utilis paralllement comme tmoin afin de vrifier le temps de chauffage ncessaire. La tempra- ture de leau dans le flacon tmoin peut tre enregistre de manire permanente laide dun thermomtre. 9.3 I

30、noculation et incubation Ajouter 50 ml de lchantillon (9.2) un flacon capuchon vis contenant 50 ml du milieu double concentration (6.2.5.3). Ajouter 10 ml de lchantillon (9.2) une srie de cinq flacons capuchon vis de 25 ml contenant 25 ml du milieu double con- centration (6.2.5.3). Ajouter 1 ml de l

31、chantillon (9.2) une srie de cinq flacons capuchon vis de 25 ml contenant 25 ml du milieu simple con- centration (6.2.5.2). Si ncessaire, ajouter 1 ml dune dilution au I/l0 de Ichantil- Ion (9.2) une srie de cinq flacons capuchon vis contenant 25 ml du milieu simple concentration (6.2.5.2). Afin de

32、procder un examen qualitatif de 100 ml deau pota- ble ou deau en bouteille sans faire un comptage du NPP, utili- ser une fiole de 200 ml contenant un mlange de 100 ml du milieu double concentration (6.2.5.3) et de 100 ml de Ichantil- Ion (9.2). Si ncessaire, remplir tous les flacons avec le milieu s

33、imple con- centration (6.2.5.2), de facon amener le liquide au niveau du col et sassurer quil ne reste quun trs petit volume dair; fer- mer alors les flacons hermtiquement ou incuber dans des con- ditions anarobies. Incuber les flacons inoculs 37 + 1 OC pendant 44 + 4 h. NOTE - Des volumes important

34、s de bouillon de culture dans des fla- cons en verre hermtiquement ferms peuvent exploser en raison de la production de gaz. Laddition dun fil de fer chauff au rouge et plac dans le milieu avant inoculation peuvent favoriser Ianarobiose. 9.4 Interprtation Les flacons dans lesquels on observe un noir

35、cissement rsul- tant de la rduction du sulfite et de la prcipitation du sulfure de fer(ll) doivent tre considrs comme tant positifs. 10 Expression des rsultats Exprimer les rsultats en conformit avec IISO 8199. 11 Procs-verbal dessai Le procs-verbal dessai doit indiquer la mthode utilise et exprimer

36、 les rsultats obtenus en tant que nombre le plus pro- bable dorganismes anarobies sulfito-rducteurs (clostridia) par volume dchantillon. II doit galement mentionner tous dtails du mode opratoire non spcifis dans la prsente partie de IISO 6461 ou considrs comme facultatifs, ainsi que tout incident susceptible davoir influenc les rsultats. Le procs-verbal dessai doit donner toutes les informations ncessaires permettant diden tif ier compltement lchantillon. Page blanche Page blanche Page blanche