DIN-Fachbericht 148-2006 Characterization of sludges - Detection and enumeration of Escherichia coil and Salmonella spp in sludges soils soil improvers growing media and biowastes《.pdf

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1、Juni 2006 Preisgruppe 23DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nurmit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 13.030.20; 13.080.30; 65.080!,j 20 % (m/V) und ohne vorherige Verdnnung die Filtration des Probenvolum

2、ens durch das Membranfilter behindern kann. 3.3 Gerte Mit Ausnahme der bereits steril gelieferten Ausrstung mssen die Glasgerte nach den in ISO 8199 angegebenen Anweisungen sterilisiert werden. bliche Ausrstung fr mikrobiologische Laboratorien und insbesondere Folgendes: 3.3.1 Gert zur Sterilisation

3、 durch trockene Heiluft (Trockenschrank) oder mit Dampf (Autoklav). B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9NormCD - Stand 2007-03DIN-Fachbericht 148:2006-06 9 3.3.2 temperaturgeregelte(r) Brutschrank (Brutschrnke), eingestellt auf (30 1) C und/oder (44 1) C. 3.3.3 Homogenisator (z. B. Stomach

4、er1)oder eine gleichwertige Einrichtung). 3.3.4 Membranfilter (Porenweite 0,45 m, mit Gitternetz, Cellulosenitrat, mit einem Durchmesser von 47 mm oder ein gleichwertiges). 3.3.5 Glasfaser-Filterscheiben (mit einem Durchmesser von 47 mm, z. B. Sartorius 13430-04752)oder eine gleichwertige nominelle

5、Porenweite). 3.3.6 Vakuumpumpe. 3.3.7 Vakuum-Verteilerstck. 3.3.8 sterile Homogenisierbeutel, 250 ml Fassungsvermgen, mit oder ohne integriertem Filter (integrierter Filterschicht) zum Ausschluss von groen Feststoffteilchen (z. B. Stomacherbeutel3). 3.3.9 sterile Petrischalen, mit einem Durchmesser

6、von 50 mm, zur Aufnahme des MLGA-Mediums. 3.3.10 sterile Reagenzglser mit einem Fassungsvermgen von 20 ml oder Kolben mit hnlichem Fassungsvermgen. 3.3.11 automatische Pipetten, mit denen sich Volumina von 1,0 ml bis 5,0 ml abgeben lassen. 3.3.12 sterile Pipetten, aus Glas oder aus Kunststoff fr den

7、 einmaligen Gebrauch, mit denen sich Volumina von 1 ml und 10 ml abgeben lassen. 3.3.13 sterile Spitzen fr automatische Pipetten. 3.3.14 sterile konische Zentrifugenrhrchen, mit einem Fassungsvermgen von 50 ml, aus Kunststoff fr den einmaligen Gebrauch. 3.3.15 Pinzette, sterilisierbar durch Eintauch

8、en in Ethanol und anschlieendes Abflammen. 3.4 Probenahme und Risiken 3.4.1 Allgemeines Proben mit einer Feuchtmasse von mindestens 100 g sind zu entnehmen und mglichst schnell, vorzugsweise bei (5 3) C gekhlt, an das Laboratorium zu senden. Die Proben neigen zur Grung, besonders, wenn sie unbehande

9、lt sind, und knnen pathogene Mikro-organismen enthalten. Wichtig ist, sie von Lebensmitteln und Getrnken fern zu halten und Beschdigungen zu vermeiden. Beim Bersten von Glasflaschen, die Schlamm enthalten, knnen mit Mikroorganismen kontaminierte Splitter entstehen. Kunststoffflaschen knnen ebenfalls

10、 bersten und dabei gefhrliche Sprhnebel und Aerosole erzeugen. 1) Stomacher ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokumentes und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN. 2) Sartorius 13430-0

11、475 ist die Herstellerbezeichnung des Produktes, geliefert von der Sartorius AG. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokumentes und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu ide

12、ntischen Ergebnissen fhren. 3) Stomacherbeutel ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unter-richtung der Anwender dieses Dokumentes und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN. B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9No

13、rmCD - Stand 2007-03DIN-Fachbericht 148:2006-06 10 Siehe auch Warnhinweis in der Einleitung. 3.4.2 Aufbewahrung Es ist davon abzuraten, die Proben offen im Laboratorium aufzubewahren. Wenn Proben aufbewahrt werden mssen, sind sie bei (5 3) C zu lagern. 3.4.3 Handhabung Sauberes Arbeiten ist unbeding

14、t erforderlich. Beim Umgang mit Schlammproben sind Handschuhe, Gesichts- und Augenschutz sowie ausreichender Krperschutz gegen das Bersten von Flaschen zu tragen. Das entstandene Gas ist in der Regel entflammbar, deshalb muss die gesamte in der Nhe angewendete Ausrstung flammfest sein, und jegliche

15、Zndquellen mssen vermieden werden. Siehe auch Warnhinweis in der Einleitung. 3.5 Reagenzien, Verdnnungsmittel und Kulturmedien 3.5.1 Allgemeine Anforderungen Zur Sicherstellung reproduzierbarer Ergebnisse sind Kulturmedien und Verdnnungsmittel aus Bestandteilen gleich bleibender Qualitt und Chemikal

16、ien von anerkannter Analysenreinheit oder aus einer gebrauchs-fertigen wasserfreien Zubereitung zur Herstellung des Verdnnungsmittels oder Fertigmediums nach den Anweisungen des Herstellers zu verwenden. Sie sind mit demineralisiertem oder destilliertem Wasser herzustellen, das frei von Substanzen i

17、st, die unter den Prfbedingungen das Wachstum hemmen knnen. Falls die Medien nicht sofort verwendet werden, knnen sie bei (5 3) C im Dunkeln unter Bedingungen, die jegliche Vernderungen der Zusammensetzung der Medien verhindern, bis zu einem Monat aufbewahrt werden. Die Verwendung von Chemikalien an

18、derer Reinheitsgrade ist zulssig, vorausgesetzt, es wurde nach-gewiesen, dass sie bei der Prfung ein gleichwertiges Leistungsverhalten aufweisen. 3.5.2 Verdnnungsmittel mit maximaler Rckgewinnung (MRD) 1 g bakteriologisches Pepton (Bactopepton) (Oxoid L374)oder eine gleichwertige Substanz) 8,5 g Nat

19、riumchlorid demineralisiertes oder destilliertes Wasser bis auf 1 000 ml Das Verdnnungsmittel ist nach den Anweisungen des Herstellers herzustellen. Es ist fr 15 min bis 20 min im Autoklaven (3.3.1) bei (121 3) C zu sterilisieren. Die Lsung kann bis zu 3 Monate bei 4 C aufbewahrt werden. 3.5.3 Chrom

20、ogenes MLGA-Medium Membran-Laurylsulfat-Bouillon 76,2 g Natriumpyruvat 0,5 g BCIG5), Monohexylammoniumsalz 0,2 g 4) Oxoid L37 ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokumentes und bedeutet keine Anerkennung dieses genan

21、nten Produktes durch das DIN. 5) 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-glucuronid B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9NormCD - Stand 2007-03DIN-Fachbericht 148:2006-06 11 bakteriologischer Agar 10,0 g demineralisiertes oder destilliertes Wasser bis auf 1 000 ml Smtliche Inhaltsstoffe, mit Ausnahme von

22、BCIG, sind zu mischen und zum Kochen zu bringen. 200 mg BCIG sind in einer Mischung aus 2,5 ml 95%igem wssrigem Ethanol und 0,5 ml Natriumhydroxid mit einer Konzentration von 1 M zu lsen, bevor sie zu dem geschmolzenen Agar-Grundmedium hinzugefgt werden. Das Medium ist fr 15 min bis 20 min durch Aut

23、oklavieren bei (121 3) C zu sterilisieren. Anschlieend ist es in Volumenteilen von etwa 7 ml in 50-mm-Petrischalen zu gieen. Den Agar erstarren lassen und gekhlt bei 5 C im Dunkeln aufbewahren. Er ist innerhalb von 7 Tagen zu verbrauchen. 3.6 Durchfhrung 3.6.1 Probenvorbereitung Wenn grobe Beimengun

24、gen vorhanden sind, werden 10 g Probe in einen Homogenisierbeutel (3.3.8) mit integriertem Filter eingewogen. 90 ml MRD (3.5.2) sind hinzuzufgen und der Beutelinhalt ist grndlich zu durchmischen (Verdnnung A). Bei mit Kalk behandelten Materialien ist der pH-Wert mit Salzsure mit einer Konzentration

25、von 1 mol/l auf 7,0 0,5 einzustellen. Wenn beim Neutralisationsprozess der pH-Wert unter 4,5 fllt, ist eine neue Analyse mit frischem Proben-material durchzufhren. Bei anderen relevanten, zur Behandlung eingesetzten Chemikalien (z. B. Peressigsure) ist ein geeignetes Neutralisationsverfahren anzuwen

26、den (siehe z. B. DIN EN 1040:2006). Der Homogenisierbeutel (3.3.8) ist in einem Homogenisator (3.3.3) unterzubringen und der Inhalt ist fr 1 min zu homogenisieren. Der Inhalt des Homogenisierbeutels ist in Zentrifugenrhrchen zum einmaligen Gebrauch (3.3.14) zu berfhren und ein aliquoter Teil von 50

27、ml ist fr 1 min bei 200 g bis 300 g zu zentrifugieren. Die berstehende Flssigkeit ist aus den Rhrchen zu dekantieren und zum Entfernen von kleinen Partikeln durch eine Glasfaserfilterscheibe (3.3.5) zu filtrieren. ANMERKUNG Es wurde nachgewiesen, dass das oben beschriebene Verfahren die Wiederfindun

28、gsrate von E. coli nicht wesentlich verringert. 3.6.2 Probenverdnnung Die Anzahl der anschlieend zu filtrierenden Verdnnungen hngt von der vermuteten Hhe der Kontamination des zu untersuchenden Materials ab. blicherweise sollte eine Reihenverdnnung von Verdnnung A von 101bis 103mit MRD (3.5.2) durch

29、gefhrt werden. Das erlaubt die Zhlung von bis zu 104E. coli je g Feuchtmasse. Hhere Bakterienkonzentrationen (z. B. unbehandelter Klrschlamm kann 108bis 109E. coli je g enthalten) erfordern zustzliche Verdnnungen des Filtrats bis auf 107. Die betreffende Anzahl an sterilen Reagenzglsern oder Flasche

30、n (3.3.10), die der Anzahl gewhlter Verdn-nungen entspricht, ist vorzubereiten; in jedes Reagenzglas (jede Flasche) sind 9 ml steriles MRD (3.5.2) einzufllen. Mit einer sterilen Pipette (3.3.12) ist 1 ml des Filtrats in das erste Reagenzglas mit 9 ml Verdnnungsmittel zu berfhren und die Lsung ist gr

31、ndlich zu durchmischen. Mit einer frischen Pipette (3.3.12) ist 1 ml der verdnnten Probe in das zweite Reagenzglas mit 9 ml Verdn-nungsmittel zu berfhren und die Lsung ist grndlich zu durchmischen. B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9NormCD - Stand 2007-03DIN-Fachbericht 148:2006-06 12 Es

32、ist wie vorstehend beschrieben fortzufahren, bis smtliche Verdnnungen hergestellt sind. 3.6.3 Membranfiltration Je 1 ml jeder verdnnten Probe ist getrennt durch eine Membranfilter (3.3.4) zu filtrieren. Vor der Zugabe der verdnnten Probe sind 9 ml MRD auf die Membran zu geben, die sich in einem ster

33、ilen Filtergehuse befindet, um eine gleichmige Verteilung der Probe zu erreichen. 3.6.4 Resuszitierung und Zhlung von Kolonien auf chromogenem Agar Die Filter sind mit einer sterilen Pinzette (3.3.15) dem Filtergehuse zu entnehmen und auf die Oberflche einer MLGA-Platte mit einem Durchmesser von 50

34、mm (3.5.3) zu berfhren. Die Platten werden zunchst fr (4 0,5) h bei (30 1) C inkubiert. Anschlieend ist die Temperatur fr (14 2) h auf (44 1) C zu erhhen. Die positiven (grnen) Kolonien sind zu zhlen. 3.6.5 Besttigung der Identitt der Kolonien ANMERKUNG Eine weitere Besttigung fr das Vorhandensein v

35、on Salmonellae kann durch biochemische Prfung, wie z. B. mit API 20E (Biomrieux)-Teststreifen6)oder einem gleichwertigen Prfsystem, erfolgen. 3.6.6 Bestimmung des Trockenrckstandes Die Anzahl von E. coli kann auf die Feuchtmasse oder auf die Trockenmasse bezogen berechnet werden. Im letzten Fall ist

36、 es notwendig, den Trockenrckstand der Probe unter Anwendung des in DIN EN 12880:2001 beschriebenen Verfahrens zu bestimmen. Das ist parallel zur mikrobiologischen Analyse durchzufhren. 6) API 20E (Biomrieux)Teststreifen ist die Herstellerbezeichnung des Produktes, geliefert von Biomrieux. Diese Ang

37、abe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokumentes und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen fhren. B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9NormCD - Stand 2

38、007-03DIN-Fachbericht 148:2006-06 13 3.7 Auswertung Die Berechnung der Anzahl von E. coli (die je g Feuchtmasse der Ausgangs-Schlammprobe vorhanden sind) erfolgt durch Multiplikation der Anzahl der grnen Kolonien auf dem Filter mit dem Verdnnungsfaktor. cbda= Dabei ist c die Ausgangskonzentration vo

39、n E. coli; a das durch jede Membran filtrierte Volumen (blicherweise 1 ml); b der anfngliche Verdnnungsfaktor fr die Verdnnung von Schlamm in MRD (blicherweise 10); d der Verdnnungsfaktor fr die Reihenverdnnungen in Wasser (blicherweise 100bis 103). Die bezogen auf die Trockenmasse von Schlamm vorha

40、ndene Anzahl wird nach folgender Gleichung berechnet: cbdea= Dabei ist e die Trockenmasse der feuchten Ausgangs-Schlammprobe, als Massenanteil in Prozent. 3.8 Untersuchungsbericht Der Untersuchungsbericht muss folgende Angaben enthalten: a) Verweisung auf dieses Dokument (d. h. DIN-Fachbericht 148);

41、 b) smtliche Angaben, die fr die vollstndige Identifizierung der Schlammprobe notwendig sind; c) Einzelheiten zur Probenvorbehandlung, falls durchgefhrt; d) Ergebnisse der Bestimmung nach 3.7; e) smtliche Einzelheiten, die nicht in dem vorliegenden Dokument festgelegt sind, und andere Faktoren, die

42、die Ergebnisse beeinflusst haben knnen. 3.9 Verfahrenskenndaten Angaben zur Wiederholprzision und Vergleichprzision, die bei Ringversuchen erhalten wurden, sind im Anhang A (informativ) enthalten. Anhang A wird mit den Ergebnissen der Validierungsuntersuchung (Ringversuch auf europischer Ebene) ergn

43、zt, die im Rahmen des FP6-EU-Horizontal-Hyg-Projektes durchgefhrt wird. B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC9B7EF8DD9NormCD - Stand 2007-03DIN-Fachbericht 148:2006-06 14 4 Miniaturisiertes Verfahren durch Animpfen in Flssigmedium (MPN-Verfahren) zum Nachweis von Escherichia coli 4.1 Anwendungsberei

44、ch Dieser Abschnitt legt ein miniaturisiertes Verfahren der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN-Verfahren) fr den quantitativen Nachweis von Escherichia coli in Schlmmen, Bden, Bodenverbesserungsmitteln, Kultursubstraten und Bioabfall fest. Es eignet sich fr die Bewertung der logarithmischen Abnahme vo

45、n E. coli durch Behandlung sowie der Qualitt des Endproduktes. Das vorliegende Verfahren ist fr Materialien mit einem Trockenrckstand von mehr als 10 % geeignet. Bei Materialien mit einem Trockenrckstand von weniger als 20 % wird das in Abschnitt 3 festgelegte Verfahren angewendet. ANMERKUNG In dies

46、em Verfahren ist Escherichia coli wie folgt definiert: -Glucuronidase-positiver Mikroorganismus, der in der Lage ist, bei einer Inkubationstemperatur von 44 C in einem festgelegten flssigen Medium 4-Methylumbelliferyl-D-glucuronid (MUG) zu hydrolysieren. 4.2 Kurzbeschreibung Das vorliegende Verfahre

47、n basiert auf DIN EN ISO 9308-3. Der folgende Text beschreibt die Probenvorbereitung zur Herstellung einer Suspension und die anschlieende Durchfhrung der Analyse nach DIN EN ISO 9308-3, bei der Ergebnisse zur wahrscheinlichsten Keimzahl in 100 ml erhalten werden. Anschlieend wird die Keimzahl von E

48、. coli berechnet, um die Keimzahl von E. coli je Gramm Trockenrckstand von Schlamm anzugeben. Zur Durchfhrung der Analyse von E. coli in Schlmmen, Bden, Bodenverbesserungsmitteln, Kultursubstraten und Bioabfall wird im vorliegenden Dokument das gesamte Verfahren beschrieben, das einem der Verfahren

49、in DIN EN ISO 9308-3 entspricht. Der Nachweis und die Zhlung von E. coli aus Bioabfall und Boden erfordern folgende Arbeitsschritte: a) Probenvorbereitung: Suspension von Substrat in Trypton-Salz-Verdnnungslsung; b) berfhrung eines Aliquots der verdnnten Probe in eine Reihe von Mikrotiterplatten-Vertiefungen, die ein Trockenkulturm