DB33 T 963-2015 厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法.pdf
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1、ICS 65.020.01 B 05 DB33 浙江省地方标准 DB 33/T 9632015 厚皮甜瓜 种子纯度 分子标记 鉴定方法 Purity identification of Musk melon variety using molecular marker analysis 2015 - 05 - 07 发布 2015 - 06 - 07 实施 浙江省质量技术监督局 发布DB33/T 9632015 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草 。 本标准 由浙 江省 农业 厅提 出。 本标准 由浙 江省 种植 业标 准化技 术委 员会 归口 。 本标准
2、起草 单位 :宁 波市 农业科 学研 究院 、宁波市 种植业 管理 总站 。 本标准 主要 起草 人: 宋慧 、王毓 洪 、 张香 琴 、 臧全 宇 、陆惠斌 、张庆 、 范雪 莲。 DB33/T 9632015 1 厚 皮甜瓜 种子纯度 分子标 记鉴定方 法 1 范围 本标准 规定 了厚 皮甜 瓜种 子纯度 分子 检测 方法 的术 语与定 义、 原理 、 试 剂、 仪 器设备 、 操 作步 骤 和 样品纯 度判 定与 计算 。 本标准 适用 于厚 皮甜 瓜种 子纯度 鉴定 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的 。 凡是注 日期的 引用 文件 , 仅所
3、注 日期的 版本 适用 于本文 件。凡 是不 注日 期的 引用 文件, 其最 新版 本( 包括 所有的 修改 单) 适用 于本 文件。 农业部1485 号公 告-4-2010 转基 因植 物及 其 产 品成 分检测 DNA 提取和 纯化 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。 3.1 品种纯 度 品种在特征 特性方 面典型一 致的程度 ,用本 品种的种 子数占供 检本作 物样品种 子数的百 分率表 示 GB/T 3543.5-1995 ,定 义3.2。 3.2 杂株 某差异 位点 杂交 失败 ,该 位点纯 合的 单株 。 3.3 杂种一 代 某差异 位点 杂交 成功 ,该 位
4、点杂 合的 单株 。 3.4 显性标 记位 点 仅能检 测显 性等 位基 因, 不能够 区分 纯合 和杂 合基 因型的 遗传 标记 位点 。 3.5 共显性 标记 位点 DB33/T 9632015 2 同时能 检测 出显 性和 隐性 等位基 因, 能够 区分 纯合 和杂合 基因 型的 遗传 标记 位点。 3.6 随机扩 增多 态 性DNA 标记 (RAPD ) 以基因 组DNA 为模板 ,以 单 个人工 合成的 随机 多态核 苷酸序 列(通 常为10 个碱 基对) 为引物 ,在 热 稳定的Taq DNA 聚合 酶作 用下, 进行PCR 扩增。 扩增 产 物经琼 脂糖 电泳 分离、 溴 化乙锭
5、 染色 后, 在 紫外 透 视仪上 检测 多态 性。 3.7 简单重 复序 列标 记(SSR ) 根据真 核生 物中 广泛 存在 的简单 重复 序列 两端 的互 补保守 区域 设计 引物 。 由 于 核心序 列串 联重 复 数 目不同 ,PCR 扩增后 获得 的 产物长 度不同 ,通 过高分 辨率琼 脂糖凝 胶电 泳分离 、溴化 乙锭染 色后 ,在 紫 外透视 仪上 检测 多态 性。 4 原理 从厚皮 甜瓜 幼苗 新叶 中提 取基因 组DNA , 利用 分子 标 记进行PCR 扩增 , 扩增产 物在琼脂 糖凝 胶的 分子 筛效应 和电 泳分 离的 电荷 效应作 用下 进行 分离 。 通 过溴化
6、 乙锭 (EB ) 染色, 在紫外光 下发 出荧 光显 示核 酸谱带 差异 。不 同厚 皮甜 瓜品种 由于 遗传 组成 不同 ,引物 结合 后扩 增产 物不 同,出 现扩 增产 物有 和 无 、 或者扩 增片 段大 小不 同的 差异。 这些 差异 可利 用电 泳图谱 加以 鉴别 ,从 而对 种子纯 度进 行鉴 定。 5 试剂 除非另 有说 明, 仅使 用分 析纯试 剂和 去离 子水 。 5.1 引物 5.1.1 RAPD RAPD( Random Amplified Polymorphic DNA) 引物 名称、 序列 及差 异片 段大 小见表1。 表1 RAPD 引物 名称 、序 列及 差
7、异片段 大小 名称 序列(5-3) 差异片段大小(bp) RAPD-1 ACCTGGACAC 1200/1400 RAPD-2 CCACATCGGT 1200/1300 RAPD-3 ACACCGGAAC 1500 RAPD-4 CCGAACACGG 460/550 5.1.2 SSR SSR(Simple Sequence Repeat) 引物 名称 、序 列及 差异片 段大 小见 表2 。 DB33/T 9632015 3 表2 SSR 引 物名 称、 序列 及差 异片段 大小 名称 F- 序列(5-3) R- 序列(5-3) 差异片段大小(bp) SSR-1 CAAAGGGCTACAAT
8、AAC CATCATAATCACCCTATCTC 225/350/400/450 SSR-2 CAGCTCTACAACAACATCTC ATCCAACTCGACCAAGAAAC 120/130/140/550/600 SSR-3 TGAAGAGACTACCATCCCCA TTTCCTTATGAGTTAGGGTTTC 140/150/320/350 5.2 琼脂糖 5.2.1 RAPD 使用2% 普通标 准凝 胶琼脂糖 (DNA 片段分 离范 围 500 bp 20000 bp)。 5.2.2 SSR 使用 2.5%高 分辨 率标 准凝胶 琼脂 糖(DNA 片段 分离范 围40 bp 1000
9、bp )。 5.3 10 g/L 溴化乙 锭溶 液 称取1.0 g 溴化 乙锭 (EB ) ,溶于100 mL水中。 配制 和使用 时应 戴一 次性 手套 操作并 妥善 处理 废液。 5.4 10 mol/L 氢氧 化钠 溶液 称取80.0 g 氢氧 化钠 (NaOH ), 先用160 mL水溶解 后,再加 水定 容到200 mL。 5.5 0.5 mol/L 乙二 胺四 乙酸 二钠溶 液(pH 8.0) 称取18.6 g 乙二胺 四乙 酸二钠(EDTA-Na2 ), 加入70 mL 水中 ,再 加入2 g 氢氧 化钠, 加热 至完 全溶 解后,冷却至室温,用按 本标准5.4 配置氢氧化钠 溶
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