DB15 T 3170-2023 籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术规程.pdf
《DB15 T 3170-2023 籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术规程.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB15 T 3170-2023 籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术规程.pdf(12页珍藏版)》请在麦多课文档分享上搜索。
1、 ICS 65.020.01 CCS B 21 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31702023 籽用西葫芦种子病毒 RT-PCR 检测技术规程 Technical code of practice for RT-PCR detection of seed-used pumpkin(Cucurbita pepo L.)seed virus 2023-09-15 发布2023-10-15 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 31702023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农
2、牧厅提出。本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会(SAM/TC 25)归口。本文件起草单位:内蒙古农业大学。本文件主要起草人:王萍、刘杰才、陈贵华、许珂、尚鹏、李石恒、毕晓宇。DB15/T 31702023 1 籽用西葫芦种子病毒 RT-PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术中涉及的试剂与材料、仪器和设备、对照设置、样品采集、样品病毒检测、结果分析与表述。本文件适用于籽用西葫芦种子中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、小西葫芦黄化花叶病毒(Zuc
3、chini yellow mosaic virus,ZYMV)的RT-PCR检测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。黄瓜花叶病毒 cucumber mosaic virus,CMV 黄瓜花叶病毒(CMV)属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus),可以侵染1000多种植物。主要通过蚜虫以口针型非持久方式传播,也是典型的种传病毒。黄瓜花叶病毒一般为系统侵染植物,主要表现为叶片斑驳,叶肉浅绿,叶脉深绿;严重时呈现叶片皱缩,叶肉退化,蕨叶等症状。西瓜花叶病毒 watermelon mosaic vir
4、us,WMV 西瓜花叶病毒(WMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),在自然界中通过蚜虫以非持久性方式传播,也可经汁液摩擦接种传播,可侵染葫芦科、豆科、藜科等多种植物种类。受侵染的病株叶片表现花叶、畸形、新生叶片扭曲,植株生长受阻,果实畸形。小西葫芦黄化花叶病毒 zucchini yellow mosaic virus,ZYMV 小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),可由多种蚜虫以非持久性方式传播,也能通过种子传播。可侵染葫芦科、苋科、豆科等11个属的植物。小西葫芦黄化花
5、叶病毒表现为系统侵染,整株花叶、黄化、叶片皱缩、果实畸形、表面有泡状或者瘤状突起。DB15/T 31702023 2 4 试剂与材料 琼脂糖。核酸染料。10 mol/L 氢氧化钠(NaOH)溶液:在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容至 200 mL。0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(pH 8.0):称取 186 g 乙二胺四乙酸二钠,加入 70 mL 水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见 4.3)直至 EDTA-Na2完全溶解,用氢氧化钠溶液(见 4.3)调 pH 至 8.0加水定容至 100 mL。在 121 条件下灭菌 2
6、0 min。1 mol/I 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI)溶液(pH 8.0):称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 800 mL 水中,用盐酸调 pH 至 8.0 加水定容至 1000 mL。在 121 条件下灭菌 20 min。TE 缓冲液(pH 8.0):分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见 4.5)和 2 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液(见 4.4),加水定容至 1000 mL。在 121 条件下灭菌 20 min。50TAE 缓冲液:称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用 500 mL 水加热搅拌溶解后,加入100 mL 乙二胺四乙酸
7、二钠溶液(见 4.4),用冰乙酸调 pH 至 8.0,然后加水定容至 1000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。加样缓冲液:称取 250.0 mg 溴酚蓝,加入 10 mL 水,在室温下溶解 12 h;称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝,加 10 mL 水溶解;称取 50.0 g 蔗糖,加 30 mL 水溶解。混合以上 3 种溶液,加水定容至 100 mL,在 4下保存。DNA 分子量标准:可以清楚区分 100 bp500 bp 的 DNA 片段。Premix Taq 酶。CMV 病毒检测上游引物 CMV-F:5-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3,下游引物 CMV-R:5
8、-AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT-3。预期扩增目的片段大小为 345 bp(参见附录 A 中的 A.1)。WMV 病 毒 检 测 上 游 引 物 WMV-F:5 -CCAGTGGCAAAGGTGATA-3 ,下 游 引 物 WMV-R:5 -TGCTGCGTCTGAGAAATG-3。预期扩增目的片段大小为 485 bp(参见附录 A 中的 A.2)。ZYMV 病毒检测上游引物 ZYMV-F:5-ATGCAGAGGCACCATACAT-3,下游引物 ZYMV-R:5-TACTGCATTGTGTTCACACC-3。预期扩增目的片段大小为 283 bp(参见附录 A 中的 A.3)。
9、引物溶液:用 TE 缓冲液(见 4.6)将上述引物稀释到 10 mol/L。TRIzol 试剂。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒。PCR 产物回收试剂盒。pMD18-T 载体。大肠杆菌感受态细胞 DH5a。5 仪器和设备 分析天平。组织研磨仪。PCR 扩增仪。电泳槽、电泳仪等电泳装置。Nanodrop 微量分光光度计。凝胶成像系统或照相系统。DB15/T 31702023 3 6 对照设置 阳性对照 以经过RT-PCR扩增和测序分析精确含有CMV、WMV、ZYMV的样品为阳性对照。阴性对照 经过R
- 1.请仔细阅读文档,确保文档完整性,对于不预览、不比对内容而直接下载带来的问题本站不予受理。
- 2.下载的文档,不会出现我们的网址水印。
- 3、该文档所得收入(下载+内容+预览)归上传者、原创作者;如果您是本文档原作者,请点此认领!既往收益都归您。
下载文档到电脑,查找使用更方便
5000 积分 0人已下载
下载 | 加入VIP,交流精品资源 |
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB15 3170-2023 籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术规程 3170 2023 西葫芦 种子 病毒 RT PCR 检测 技术规程
