1、 ICS 65.020.01 CCS B 21 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31702023 籽用西葫芦种子病毒 RT-PCR 检测技术规程 Technical code of practice for RT-PCR detection of seed-used pumpkin(Cucurbita pepo L.)seed virus 2023-09-15 发布2023-10-15 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 31702023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农
2、牧厅提出。本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC 25）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学。本文件主要起草人：王萍、刘杰才、陈贵华、许珂、尚鹏、李石恒、毕晓宇。DB15/T 31702023 1 籽用西葫芦种子病毒 RT-PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术中涉及的试剂与材料、仪器和设备、对照设置、样品采集、样品病毒检测、结果分析与表述。本文件适用于籽用西葫芦种子中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（Zuc
3、chini yellow mosaic virus，ZYMV）的RT-PCR检测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。黄瓜花叶病毒 cucumber mosaic virus，CMV 黄瓜花叶病毒(CMV)属于雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus），可以侵染1000多种植物。主要通过蚜虫以口针型非持久方式传播，也是典型的种传病毒。黄瓜花叶病毒一般为系统侵染植物，主要表现为叶片斑驳，叶肉浅绿，叶脉深绿；严重时呈现叶片皱缩，叶肉退化，蕨叶等症状。西瓜花叶病毒 watermelon mosaic vir
4、us,WMV 西瓜花叶病毒（WMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），在自然界中通过蚜虫以非持久性方式传播，也可经汁液摩擦接种传播，可侵染葫芦科、豆科、藜科等多种植物种类。受侵染的病株叶片表现花叶、畸形、新生叶片扭曲，植株生长受阻，果实畸形。小西葫芦黄化花叶病毒 zucchini yellow mosaic virus，ZYMV 小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），可由多种蚜虫以非持久性方式传播，也能通过种子传播。可侵染葫芦科、苋科、豆科等11个属的植物。小西葫芦黄化花
5、叶病毒表现为系统侵染，整株花叶、黄化、叶片皱缩、果实畸形、表面有泡状或者瘤状突起。DB15/T 31702023 2 4 试剂与材料 琼脂糖。核酸染料。10 mol/L 氢氧化钠(NaOH)溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容至 200 mL。0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(pH 8.0)：称取 186 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见 4.3)直至 EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液(见 4.3)调 pH 至 8.0加水定容至 100 mL。在 121 条件下灭菌 2
6、0 min。1 mol/I 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI)溶液(pH 8.0)：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0 加水定容至 1000 mL。在 121 条件下灭菌 20 min。TE 缓冲液(pH 8.0)：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见 4.5)和 2 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液(见 4.4)，加水定容至 1000 mL。在 121 条件下灭菌 20 min。50TAE 缓冲液：称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，先用 500 mL 水加热搅拌溶解后，加入100 mL 乙二胺四乙酸
7、二钠溶液(见 4.4)，用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容至 1000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加入 10 mL 水，在室温下溶解 12 h；称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝，加 10 mL 水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，加 30 mL 水溶解。混合以上 3 种溶液，加水定容至 100 mL，在 4下保存。DNA 分子量标准：可以清楚区分 100 bp500 bp 的 DNA 片段。Premix Taq 酶。CMV 病毒检测上游引物 CMV-F:5-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3，下游引物 CMV-R:5
8、-AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT-3。预期扩增目的片段大小为 345 bp(参见附录 A 中的 A.1)。WMV 病 毒 检 测 上 游 引 物 WMV-F:5 -CCAGTGGCAAAGGTGATA-3 ，下 游 引 物 WMV-R:5 -TGCTGCGTCTGAGAAATG-3。预期扩增目的片段大小为 485 bp(参见附录 A 中的 A.2)。ZYMV 病毒检测上游引物 ZYMV-F:5-ATGCAGAGGCACCATACAT-3，下游引物 ZYMV-R:5-TACTGCATTGTGTTCACACC-3。预期扩增目的片段大小为 283 bp(参见附录 A 中的 A.3)。
9、引物溶液：用 TE 缓冲液（见 4.6）将上述引物稀释到 10 mol/L。TRIzol 试剂。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒。PCR 产物回收试剂盒。pMD18-T 载体。大肠杆菌感受态细胞 DH5a。5 仪器和设备 分析天平。组织研磨仪。PCR 扩增仪。电泳槽、电泳仪等电泳装置。Nanodrop 微量分光光度计。凝胶成像系统或照相系统。DB15/T 31702023 3 6 对照设置 阳性对照 以经过RT-PCR扩增和测序分析精确含有CMV、WMV、ZYMV的样品为阳性对照。阴性对照 经过R
10、T-PCR扩增和测序分析精确不含有CMV、WMV、ZYMV的样品为阴性对照。空白对照 以灭菌ddH2O为空白对照。7 样品采集 采集适量的籽用西葫芦种子，放入自封袋中封口后及时进行分析。如需保存可置于-80冰箱中。样品应避免交叉污染。8 样品病毒检测 RNA 提取和纯度检测 8.1.1 每个对照和试样设置 2 次重复。8.1.2 RNA 提取：选取感染病毒的籽用西葫芦种子 50 粒，冷冻研磨至粉状后，称取 0.1 g 待测样品置于灭菌 2 mL 离心管中，加入 1 mL TRIzol 试剂后混匀，提取籽用西葫芦种子总 RNA。8.1.3 RNA浓度检测：提取的样品总RNA用Nanodrop微量
11、分光光度计测定RNA相对浓度，当OD260/OD280比值为 1.82.0 时，可用于 RT-PCR 检测。8.1.4 RNA 质量检测：称量 1 g 琼脂糖加入到 100 mL 1TAE 缓冲液中，加热混匀。冷却后加入 2 L 核酸染料，混匀，将其倒入电泳槽，插上梳板。室温下凝固成凝胶后，倒入 1TAE 缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取 2 L RNA 与 4 L 加样缓冲液混合后，加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔加入 DNA 分子量标准，进行电泳检测。电泳结束后，观察结果（参见附录 B.1）。如果总 RNA 条带清楚，就可以用于后续实验。反转录 8.2.1 每个对照和试样设置 2 次
12、重复。8.2.2 以总 RNA 为模板，进行反转录合成第一链 cDNA。在离心管中加入 1 g RNA模板，1 L Anchored Oligo（dT）18 引物和 RNase-Free ddH2O，混匀，65 孵育 5 min，冰浴 2 min。然后加入 10 L 2TS 反应液，1 L 反转录酶和 1 L gDNA Remover，轻轻混匀，42 孵育 30 min。85 加热 5 sec终止反应，-20 冰箱保存备用。PCR 扩增 8.3.1 每个对照和试样 PCR 扩增设置 2 次重复。8.3.2 按表 1 依次加入反应试剂，混匀，分装到 PCR 管中。DB15/T 31702023
13、4 表1 PCR 扩增体系 试剂 体积 Premix Taq 25L cDNA 2L 10mol/L上游引物 1L 10mol/L下游引物 1L ddH2O 补足50L 8.3.3 将 PCR 管放在离心机上，瞬时离心 2 sec，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。8.3.4 PCR 反应程序：94 预变性 3 min；94 变性 30 sec，退火 30 sec（CMV 58，WMV 50，ZYMV 50），72 延伸 1 min，35 个循环；72 延伸 10 min，4 保存。8.3.5 反应结束后取出 PCR 管，对 PCR 扩增产物进行电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测 8.4.1
14、 称量 1 g 琼脂糖加入到 100 mL 1TAE 缓冲液中，加热混匀。冷却后加入 2 L 核酸染料，混匀，将其倒入电泳槽，插上梳板。室温下凝固成凝胶后，倒入 1TAE 缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取 2 L RNA 与 4 L 加样缓冲液混合后，加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔加入 DNA 分子量标准，进行电泳检测。电泳结束后，观察结果。8.4.2 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上成像，进行结果分析。如需通过序列分析确认 PCR 扩增片段是否为目的 DNA 片段，按照 8.4.3 的规定执行。8.4.3 PCR 产物用凝胶回收试剂盒纯化目的片段，并在 4 连接至 pMD
15、18-T 载体，转化到大肠杆菌感受态细胞 DH5a，经红白斑筛选，挑取阳性克隆，送至测序。测序引物为病毒特异性引物。获得的序列与NCBI 数据库的 CMV、WMV、ZYMV 病毒序列(参见附录 A)比对，确定 PCR 扩增的 DNA 片段是否为目的 DNA片段。9 结果分析与表述 CMV 基因检测结果分析 9.1.1 判定条件：RT-PCR 特异性扩增产物在 345 bp 处有无条带（参见附录 B 中的图 B.2）9.1.2 试样和阳性对照扩增出 CMV 病毒特异性条带，阴性对照和空白对照未得到扩增。说明被检测样品感染 CMV 病毒。9.1.3 试样、阴性对照和空白对照未扩增出 CMV 病毒特
16、异性条带，阳性对照扩增出 CMV 特异性条带。说明被检测样品未感染 CMV 病毒。9.1.4 阳性对照未扩增出 CMV 特异性条带，试样、阴性对照和空白对照扩增出 CMV 特异性条带或条带不清楚。说明检测结果无效，将实验中的所有试剂更换，并重新提取样品 RNA，进行 RT-PCR 检测。WMV 基因检测结果分析 9.2.1 判定条件：RT-PCR 产物在 485 bp 处有无条带（参见附录 B 中的图 B.2）9.2.2 试样和阳性对照扩增出 WMV 病毒特异性条带，阴性对照和空白对照未得到扩增。说明被检测样品感染 WMV 病毒。9.2.3 试样、阴性对照和空白对照未扩增出 WMV 病毒特异性
17、条带，阳性对照扩增出 WMV 特异性条带。说明被检测样品未感染 WMV 病毒。DB15/T 31702023 5 9.2.4 阳性对照未扩增出 WMV 特异性条带，试样、阴性对照和空白对照扩增出 WMV 特异性条带或条带不清楚。说明检测结果无效，将实验中的所有试剂更换，并重新提取样品 RNA，进行 RT-PCR 检测。ZYMV 基因检测结果分析 9.3.1 判定条件：RT-PCR 产物在 283 bp 处有无条带（参见附录 B 中的图 B.2）9.3.2 试样和阳性对照扩增出 ZYMV 病毒特异性条带，阴性对照和空白对照未得到扩增。说明被检测样品感染 ZYMV 病毒。9.3.3 试样、阴性对照
18、和空白对照未扩增出 ZYMV 病毒特异性条带，阳性对照扩增出 ZYMV 特异性条带。说明被检测样品未感染 ZYMV 病毒。9.3.4 阳性对照未扩增出 ZYMV 特异性条带，阴性对照和空白对照扩增出 ZYMV 特异性条带或条带不清楚。说明检测结果无效，将实验中的所有试剂更换，并重新提取样品 RNA，进行 RT-PCR 检测。DB15/T 31702023 6 A A 附录A （资料性）籽用西葫芦种子 CMV/WMV/ZYMV 特异性片段序列 A.1 CMV 特异性片段序列 A.2 WMV 特异性片段序列 A.3 ZYMV 特异性片段序列 注1：序列方向为5-3。注2：5下划线为PCR方法上游引
19、物序列，3下划线为PCR方法下游引物的反向互补序列。DB15/T 31702023 7 B B 附录B （资料性）籽用西葫芦种子 CMV/WMV/ZYMV RT-PCR 检测电泳图 B.1 籽用西葫芦种子总 RNA 电泳图谱见图 B.1。图B.1 籽用西葫芦种子总 RNA 电泳图 B.2 籽用西葫芦种子 CMV/WMV/ZYMV RT-PCR 检测电泳图见图 B.2。28s18s5sCMVWMVDB15/T 31702023 8 标引序号说明：M DNA Marker 1-2 感染病毒的检测样品 3-4 未感染病毒的检测样品 PC1-PC2 阳性对照 NC1-NC2 阴性对照 CK1-CK2 空白对照 图B.2 籽用西葫芦种子 CMV/WMV/ZYMV RT-PCR 检测电泳图 ZYMV
