DB32 T 3762.10-2020 新型冠状病毒检测技术规范 第10部分：微量血清中和试验.pdf

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1、 ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.102020 新型冠状病毒检测技术规范 第 10 部分：微量血清中和试验 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 10: Serum microneutralization test 2020 - 07 - 29 发布 2020 - 07 - 30 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3762.102020 I 前 言 DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范 目前分为以下部分 ： 第 1部分：生物样本采集、运输和

2、保存； 第 2部分：病毒分离与鉴定； 第 3部分：核酸荧光 PCR检测程序； 第 4部分：重组酶介导等温扩增程序； 第 5部分：血清 IgM和 IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； 第 6部分：血清 IgM和 IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； 第 7部分：空气样 本 检测与评估； 第 8部分：物体表面检测与评估； 第 9部分：医务人员职业暴露检测与评估 ； 第 10部分：微量血清中和试验 ； 第 11部分： 全基因组高通量测序 。 本部分为 DB32/T 3762 的第 10部分。 本部分按照 GB/T 1.1-2009 给 出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生

3、标准化技术委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、 南京医科大学、 苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本 部分 主要起草人： 葛以跃、崔仑标、迟莹、郭喜玲、陈银、朱宝立 、 程军平 、 钱志远、罗晓明、 沈欢喜。 DB32/T 3762.102020 1 新型冠状病毒检测技术规范 第 10 部分 ： 微量血清中和试验 1 范围 本部分规定了新型冠状病毒微量血清中和试验环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操作步骤、 结果判定和清场与消毒。 本部分适用于新型冠状病毒实验室微量血 清中和试验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注

4、日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 微量 血清 中和试验 serum microneutralization test 将病原体及其产物（毒素）与免疫血清相混合，在体内或体外检测其致病力的试验，用以检查动物 的免疫状态 ， 测定抗原滴度，以及病原 鉴定 等。 3.2 细胞病变效应 cytopathic effect， CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感

5、细胞培养都能引 起其显微 镜下 表现 的 改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体， 乃至细胞裂解等。 3.3 半数组织培养感染剂量 median tissue culture infective dose (TCID50) 能 在 培养板孔或试管内 引起半数细胞病变或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。 4 环境与设施 4.1 实验室资质及级别要求 DB32/T 3762.102020 2 应符合 新型冠状 病毒实验室生物安全指南 的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定、 中和试验等实验操作应当在生物安全三级实验室 （ BSL-3） 的生物安全柜内进行。

6、实验室开展相关活动 前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。 4.2 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应经过生物安全培训并取得 BSL-3实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下 经 实验室主任 批准后 方可开展活动 。 操作人员 应 根据 新型冠状病毒实验室生物安全指南 要求 ，按照 BSL-3个人防护的要求进行防护。 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋 器、冰箱、 CO2培养箱等。 5.2 耗材 N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性 PE手套、一次性手术衣、乳胶 手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯 Ti

7、p头、一次性平皿、离心管、 96孔细胞培养板等。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 Hanks 溶液（每毫升含青霉素 、链霉素各 2000 单位） 6.1.2 DMEM 培养液（含 10%胎牛血清）。 6.1.3 DMEM 维持液（含 2%胎牛血清）。 6.1.4 消化液 （ 0.25%胰酶和 0.025% EDTA-Na2 混合液）。 6.2 材料 6.2.1 已滴定的新型冠状病毒悬液。 6.2.2 阳性对照血清、阴性对照血清（正常血清）及待检血清。 6.2.3 非洲绿猴肾传代细胞（ VERO-E6） 、 人呼吸道上皮细胞 、 人肝癌细胞（ Huh7） 或 其 它敏感 细胞 。 7

8、试验技术要点 7.1 确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒病毒株滴度，应至少有三次独立的滴度水平测定结果， 三次实验结果的滴度波动不应超过 +/-0.5。 7.2 中和抗体滴度的判定是以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，因此设置对照实验十 分重要。 7.3 采用固定病毒 稀释血清的方法 进行微量中和试验。 8 操作步骤 8.1 实验前准备 DB32/T 3762.102020 3 8.1.1 将实验所需细胞置 37 5% CO2 培养箱培养至单层，在 进入 BSL-3 接种病毒前，弃掉细胞培养 液，用 Hanks 溶液洗 3 次。 8.1.2 配备消毒液： 75%乙醇、 有效氯 55

9、00 mg/L 的 含氯消毒 液 。 8.1.3 将细胞、病毒、血清、试剂和耗材一次性带入 BSL-3 核心区。 8.2 血清稀释 8.2.1 血清的处理：将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清 56 水浴灭活 30 min，为防止管盖 崩开，要用封口膜封管口。待冷却后移至生物安全柜内进行稀释。 8.2.2 在生物安全柜里，将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清用 DMEM 维持液做倍比稀释， 使其稀释度分别为 1： 4、 1： 8、 1： 16、 1： 32、 1： 64、 1： 128，每 管量为 0.5 ml。每一稀释度必须更 换吸头，吹打混匀。 8.3 病毒稀释 在生物安全柜里，用 D

10、MEM 维持液稀释病毒至 100TCID50/0.1ml。 8.4 血清与病毒结合 8.4.1 在上述各稀释的血清管内加 0.5 ml 病毒稀释液（ 100TCID50/0.1ml ），充分混匀，拧紧管盖， 用封口膜封口后置 37 水浴 1 h。 8.4.2 病毒对照为 0.5 ml 病毒稀释液（ 100TCID50/0.1ml ）加 0.5 ml 的维持液，同样用封口膜封口后 置 37 水浴 1 h。 8.4.3 正常细胞对照不加病毒，仅含 DMEM 维持液。 8.5 接种细胞 8.5.1 弃去细胞培养孔中的 Hanks 液。 8.5.2 将每个稀释度的血清病毒混合物接种到单层细胞上，每一稀

11、释度接种 4 孔，每孔 0.2 ml。 8.5.3 将接种好样品的 96 孔培养板置 37 5% CO2 培养箱中培养。 8.6 结果观察 每 24 h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（ CPE），并记录结果，观察 5 d 7 d，以 0% 25%细胞 CPE变化为 “+”， 26% 50%细胞 CPE变化为 “+”， 51% 75%细胞 CPE变化为 “+”， 76% 100%细胞 CPE变化为 “+”，正常细胞形态为 “-”。以病毒对照出现 “+ +”时，结束试验。 9 结果判定 9.1 质控要求 正 常细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应出现 “+ +”的 CPE变化；能够阻止产

12、生 CPE的阳性对照血清可以中和病毒的感染性，故阳性对照血清孔应无 CPE，与正常细胞对照孔相同； 阴性对照血清孔的 CPE情况应与病毒对照孔相同。 9.2 50%血清中和终点的计算 50%血清中和终点为能保护 50%细胞不产生病变的血清最高稀释度，即为中和终点，可按 Reed-Muench法计算结果 ， 参见表 1。 DB32/T 3762.102020 4 表 1 某新型冠状病毒病人恢复期血清 50%血清中和终点的计算 血清稀释度 细胞病变管数 /总管数 细胞 病变分布 累计 阳性 比例 阳性 率 （ %） （ +）管 （ -）管 （ +） （ -） 1:4 （ 10-0.6) 1:8 (

13、10-0.9) 1:16 (10-1.2) 1:32 (10-1.5) 1:64 (10-1.8) 1:128 (10-2.1) 0/4 0/4 0/4 1/4 3/4 4/4 0 0 0 1 3 4 4 4 4 3 1 0 0 0 0 1 4 8 16 12 8 4 1 0 0/16 0/12 0/8 1/5 4/5 8/8 0 0 0 20 80 100 注 1： 计算公式为 ： lg50%血清中和终点 =b+dc, b为 小于 50%阳性 率血清稀释度的对数 ， d为 距离比例 ， c为 稀释系数 的对数 ，其中 d=（ 50小于 50%的阳性率） /（大于 50的阳性率小于 50%的阳

14、性率） 。 注 2： 本例中 ： d= (50 20)/(80 20) 0.5， lg50%血清中和终点 =-1.5+0.5(-0.3)=-1.65， -1.65的反对数为 1:45， 既 1:45 的血清可保护 50%细胞不产生病变。 10 清场与消毒 10.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用 75乙醇擦拭外表面后，移出生物安全柜。 10.2 将实验过程产生的所有污染材料经 121 ， 30 min 高压消毒灭菌处理。 10.3 用新鲜配制的 有效氯 5500 mg/L 的 含氯消毒液 擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，不要擦拭 顶棚，作用 后 用清水擦拭以除去残余消毒液 ， 关闭 生物安全柜，紫外 灯消毒 30 min。 10.4 按照 合理程序 在指定脱卸 区域 脱卸个人防护用品， 退出 BSL-3， 填写 BSL-3 相关实验记录。 _