DB32 T 3762.11-2020 新型冠状病毒检测技术规范 第11部分：全基因组高通量测序.pdf

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1、ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.112020 新型冠状病毒检测技术规范 第 11 部分：全基因组高通量测序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 11: Whole genome high-throughput sequencing 2020 - 07 - 29 发布 2020 - 07 - 30 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3762.112020 I 前 言 DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术 规范 目前分为以下部分 ： 第 1部分：

2、生物样本采集、运输和保存； 第 2部分：病毒分离与鉴定； 第 3部分：核酸荧光 PCR检测程序； 第 4部分：重组酶介导等温扩增程序； 第 5部分：血清 IgM和 IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； 第 6部分：血清 IgM和 IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； 第 7部分：空气样 本 检测与评估； 第 8部分：物体表面检测与评估； 第 9部分：医务人员职业暴露检测与评估； 第 10部分： 微量血清中和试验 ； 第 11部分： 全基因组 高通量 测序 。 本部分为 DB32/T 3762 的第 11部分。 本部分按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出

3、。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心 、 南京医科大学 、 苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本 部分 主要起草人： 崔仑标、葛以跃、赵康辰、朱小娟、朱宝立 、 程军平 、 钱志远、罗晓明、沈欢 喜。 DB32/T 3762.112020 1 新型冠状病毒检测技术规范 第 11 部分 ： 全基因组 高通量 测序 1 范围 本 部分 规定了新型冠状病毒 全基因组 高通量 测序 的 环境与设施、设备与耗材、试剂、样 本前处理与 核酸提取、 全基因组测序 、结果 分析 。 本部分适用于新型冠状病毒 全基因组 高通量 测序 。

4、 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构临床基因扩增管理办法 原卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原卫生部检验中心 国家卫生计生委对高 通量测序试点实验室的要求 原 国家卫生计生委 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 全基因组测序 whole genome sequencing 对生物体整个基因组 序

5、列 进行 测定 ，以获得完整的基因组信息 。 3.2 高通量测序 high-throughput sequencing 能一次并行对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测定 的技术 ，又称 “下一代 ”测序 （ next-generation sequencing）或深度测序（ deep sequencing） 技术 。 3.3 Reads 高通量测序平台产生的 序列 称为 reads，即测序读到的碱基序列片段，是测序的最小单位 。 3.4 测序深度 sequencing depth 测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 DB32/T 3762.112020 2 3.5 测序覆盖度 s

6、equencing coverage 测序得到的序列占整个基因组的比例。 4 环境与 设施 4.1 实验室资质及级别要求 应 符合 新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的 方法灭活前进行核酸提取及临床样本的灭活等操作，应在生物安全二级实验室（ BSL-2）进行，同时采 用生物安全三级实验室（ BSL-3）的个人防护 ； 感染 性材料或活病毒在采用 可靠 方法灭活后 进行的核酸 检测操作应在 BSL-2进行。 cDNA制备后的相关操作可在 生物安全 一 级实验室 （ BSL-1） 进行。 全基因组 测序实验室 应 符合 GB 19489、 国家卫生计生委对高

7、通量测序试点实验室的要求、 医疗机构临床 基因扩增管理办法、医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则相关要求。 4.2 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应经过生物安全培训并取得实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入 。样 本制备及核酸提取 防护 参照 DB32/T 3762.3的第 4章 进行 ， 测序相关操作 采用 BSL-1的个人防护。 5 设备与耗材 5.1 设备 PCR扩增仪 、 核酸提取仪 、 核酸定量仪、 高通量测序 仪 。 5.2 耗材 微量移液器及各种配套带滤芯 Tip头 、 96孔板磁力架、 1.5 mL EP管 、 0.2 mL 8联排管、 96孔 PCR板 。

8、6 试剂 核酸提取试剂盒、 核酸定量试剂盒、 第一链 cDNA合成试剂盒、 随机六聚体引物 、 经验证可靠的 适 合 多重 反应 的 PCR扩增试剂盒 、 DNA纯化磁珠、 文库制备试剂盒、 高通量测序试剂盒 。 7 样本前处理 与 核酸提取 参照 DB32/T 3762.3的 第 7章 进行 。 8 模板 制备 8.1 cDNA 制备 以提取的核酸为模板， 采用 第一链 cDNA合成试剂盒 和 随机六聚体引物 ， 根据 试剂盒 说明书 在 PCR 扩增仪上 制备第一链 cDNA。 DB32/T 3762.112020 3 8.2 混合 引物 8.2.1 将所有扩增引物 （ 附录 A） 配置

9、为 100M 储存浓度， 将 49 对 Pool 1 的引物 各取 5L 混匀， 得 490L Pool 1 引物 池 （ 引物总浓度为 100M） ， 同样将 49 对 Pool 2 的引物各取 5L 混匀，得 490L Pool 2 引物池 （ 引物总浓度为 100M） 。 8.2.2 以去离子水分别将 Pool 1 和 Pool 2 引物池作 10 倍稀释， 使其 引物总 浓度 均为 10M ， 分装 后 储 存以防止污染和降解。 8.3 多重 PCR 扩增 8.3.1 采用 PCR 扩增试剂 盒 ， 根据试剂盒说明书配置多重 PCR 扩增 体系， 反应体系中每一条引物的 终浓度为 0.

10、015M， Pool 1 和 Pool 2 各配置一套扩增体系 ，每 25L 反应体系中加入 2L cDNA 模板 。 8.3.2 按以下 参数进行 PCR 扩增 ： 98 30s； 98 15s， 65 5min， 扩增 30 循环； 4 hold。 8.4 PCR 产物的纯化 8.4.1 将每一份样本的 Pool 1 扩增产物和 Pool 2 扩增产物 混合于新的 8联排 PCR管或 96 孔 PCR 板中 。 8.4.2 采用 DNA 纯化 磁珠 法 对混合后的扩增产物进行纯化 ，以 30L TE buffer (10 mM tris-HCl pH8.0, 0.1 mM EDTA)洗脱

11、纯化后 的产物 。 9 DNA 文库构建 9.1 纯化 产物的 定量与标化 使用核酸定量试剂盒 对纯化产物 进行 双链 DNA定量， 根据所使用建库试剂盒说明对其进行 标化 。 9.2 DNA 文库制备与混合 根据所使用 的 建库试剂盒说明 书 进行文库制备、定量和 文库 混合 。 10 上机测序 根据 高通量测序试剂盒和 高通量 测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序 。 11 结果 分析 可采用不同的生物信息学软件进行 测序 结果 的 分析 ： 首先 去除 测序数据中的 PCR引物 序列 （ 按照最 大 引物长度 30bp进行 Trim） 和低质量的 Reads， 然后 以 SA

12、RS-CoV-2 参考基因组 （ GeneBank号： MN908947.3） 为模板进行序列 mapping， mapping之后对 测序覆盖度和 测序深度 进行分析 ， 最终生成 一 致性（ consensus） 序列 ，即为 待测样本的 全基因组序列 。 DB32/T 3762.112020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 多重 PCR 扩增引物序列 序号 引物名称 所属引物池 引物序列（ 5-3） 长度 1 nCoV-2019_1_LEFT Pool 1 ACCAACCAACTTTCGATCTCTTGT 24 2 nCoV-2019_1_RIGHT Pool 1 AAGTGCC

13、ATCTTTAAGATGTTGACG 25 3 nCoV-2019_2_LEFT Pool 2 CTGTTTTACAGGTTCGCGACGT 22 4 nCoV-2019_2_RIGHT Pool 2 TAAGGATCAGTGCCAAGCTCGT 22 5 nCoV-2019_3_LEFT Pool 1 CGGTAATAAAGGAGCTGGTGGC 22 6 nCoV-2019_3_RIGHT Pool 1 AAGGTGTCTGCAATTCATAGCTCT 24 7 nCoV-2019_4_LEFT Pool 2 GGTGTATACTGCTGCCGTGAAC 22 8 nCoV-2019_4_

14、RIGHT Pool 2 CACAAGTAGTGGCACCTTCTTTAGT 25 9 nCoV-2019_5_LEFT Pool 1 TGGTGAAACTTCATGGCAGACG 22 10 nCoV-2019_5_RIGHT Pool 1 ATTGATGTTGACTTTCTCTTTTTGGAGT 28 11 nCoV-2019_6_LEFT Pool 2 GGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCG 22 12 nCoV-2019_6_RIGHT Pool 2 TAGCGGCCTTCTGTAAAACACG 22 13 nCoV-2019_7_LEFT Pool 1 ATCAGAGGCTGC

15、TCGTGTTGTA 22 14 nCoV-2019_7_RIGHT Pool 1 TGCACAGGTGACAATTTGTCCA 22 15 nCoV-2019_8_LEFT Pool 2 AGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGA 24 16 nCoV-2019_8_RIGHT Pool 2 GCTTCAACAGCTTCACTAGTAGGT 24 17 nCoV-2019_9_LEFT Pool 1 TCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGA 24 18 nCoV-2019_9_RIGHT Pool 1 TTTATGACAGCATCTGCCACAA 22 19 nCoV-2019

16、_10_LEFT Pool 2 TGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGT 24 20 nCoV-2019_10_RIGHT Pool 2 TCATCTAACCAATCTTCTTCTTGCTCT 27 21 nCoV-2019_11_LEFT Pool 1 GGAATTTGGTGCCACTTCTGCT 22 22 nCoV-2019_11_RIGHT Pool 1 TCATCAGATTCAACTTGCATGGCA 24 23 nCoV-2019_12_LEFT Pool 2 AAACATGGAGGAGGTGTTGCAG 22 24 nCoV-2019_12_RIGHT Pool 2 TT

17、CACTCTTCATTTCCAAAAAGCTTGA 27 25 nCoV-2019_13_LEFT Pool 1 TCGCACAAATGTCTACTTAGCTGT 24 26 nCoV-2019_13_RIGHT Pool 1 ATAACCACAGCAGTTAAAACAC 22 27 nCoV-2019_14_LEFT Pool 2 CATCCAGATTCTGCCACTCTTGT 23 28 nCoV-2019_14_RIGHT Pool 2 AGTTTCCACACAGACAGGCATT 22 29 nCoV-2019_15_LEFT Pool 1 ACAGTGCTTAAAAAGTGTAAAA

18、GTGCC 27 30 nCoV-2019_15_RIGHT Pool 1 AGAAACAGAAACTGTAGCTGGC 22 31 nCoV-2019_16_LEFT Pool 2 AATTTGGAAGAAGCTGCTCGGT 22 32 nCoV-2019_16_RIGHT Pool 2 CACAACTTGCGTGTGGAGGTTA 22 33 nCoV-2019_17_LEFT Pool 1 CTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACT 27 34 nCoV-2019_17_RIGHT Pool 1 TTTGTTGGAGTGTTAACAATGCAGT 25 35 nCoV-20

19、19_18_LEFT Pool 2 TGGAAATACCCACAAGTTAATGGTTTAAC 29 DB32/T 3762.112020 5 序号 引物名称 所属引物池 引物序列（ 5-3） 长度 36 nCoV-2019_18_RIGHT Pool 2 AGCTTGTTTACCACACGTACAAGG 24 37 nCoV-2019_19_LEFT Pool 1 GCTGTTATGTACATGGGCACACT 23 38 nCoV-2019_19_RIGHT Pool 1 TGTCCAACTTAGGGTCAATTTCTGT 25 39 nCoV-2019_20_LEFT Pool 2 AC

20、AAAGAAAACAGTTACACAACAACCA 27 40 nCoV-2019_20_RIGHT Pool 2 ACGTGGCTTTATTAGTTGCATTGTT 25 41 nCoV-2019_21_LEFT Pool 1 TGGTGGCTATTGATTATAAACACTACACA 29 42 nCoV-2019_21_RIGHT Pool 1 TAGATCTGTGTGGCCAACCTCT 22 43 nCoV-2019_22_LEFT Pool 2 ACTACCGAAGTTGTAGGAGACATTATACT 29 44 nCoV-2019_22_RIGHT Pool 2 ACAGTAT

21、TCTTTGCTATAGTAGTCGGC 27 45 nCoV-2019_23_LEFT Pool 1 ACAACTACTAACATAGTTACACGGTGT 27 46 nCoV-2019_23_RIGHT Pool 1 ACCAGTACAGTAGGTTGCAATAGTG 25 47 nCoV-2019_24_LEFT Pool 2 AGGCATGCCTTCTTACTGTACTG 23 48 nCoV-2019_24_RIGHT Pool 2 ACATTCTAACCATAGCTGAAATCGGG 26 49 nCoV-2019_25_LEFT Pool 1 GCAATTGTTTTTCAGCT

22、ATTTTGCAGT 27 50 nCoV-2019_25_RIGHT Pool 1 ACTGTAGTGACAAGTCTCTCGCA 23 51 nCoV-2019_26_LEFT Pool 2 TTGTGATACATTCTGTGCTGGTAGT 25 52 nCoV-2019_26_RIGHT Pool 2 TCCGCACTATCACCAACATCAG 22 53 nCoV-2019_27_LEFT Pool 1 ACTACAGTCAGCTTATGTGTCAACC 25 54 nCoV-2019_27_RIGHT Pool 1 AATACAAGCACCAAGGTCACGG 22 55 nCo

23、V-2019_28_LEFT Pool 2 ACATAGAAGTTACTGGCGATAGTTGT 26 56 nCoV-2019_28_RIGHT Pool 2 TGTTTAGACATGACATGAACAGGTGT 26 57 nCoV-2019_29_LEFT Pool 1 ACTTGTGTTCCTTTTTGTTGCTGC 24 58 nCoV-2019_29_RIGHT Pool 1 AGTGTACTCTATAAGTTTTGATGGTGTGT 29 59 nCoV-2019_30_LEFT Pool 2 GCACAACTAATGGTGACTTTTTGCA 25 60 nCoV-2019_3

24、0_RIGHT Pool 2 ACCACTAGTAGATACACAAACACCAG 26 61 nCoV-2019_31_LEFT Pool 1 TTCTGAGTACTGTAGGCACGGC 22 62 nCoV-2019_31_RIGHT Pool 1 ACAGAATAAACACCAGGTAAGAATGAGT 28 63 nCoV-2019_32_LEFT Pool 2 TGGTGAATACAGTCATGTAGTTGCC 25 64 nCoV-2019_32_RIGHT Pool 2 GGTAATAGCACATCACTACGCAAC 24 65 nCoV-2019_33_LEFT Pool

25、1 ACTTTTGAAGAAGCTGCGCTGT 22 66 nCoV-2019_33_RIGHT Pool 1 TGGACAGTAAACTACGTCATCAAGC 25 67 nCoV-2019_34_LEFT Pool 2 TCCCATCTGGTAAAGTTGAGGGT 23 68 nCoV-2019_34_RIGHT Pool 2 AGTGAAATTGGGCCTCATAGCA 22 69 nCoV-2019_35_LEFT Pool 1 TGTTCGCATTCAACCAGGACAG 22 70 nCoV-2019_35_RIGHT Pool 1 ACTTCATAGCCACAAGGTTAA

26、AGTCA 26 71 nCoV-2019_36_LEFT Pool 2 ATTACAGTTAATGTTTTAGCTTGGTTGTA 22 72 nCoV-2019_36_RIGHT Pool 2 GAACAAAGACCATTGAGTACTCTGGA 26 73 nCoV-2019_37_LEFT Pool 1 ACACACCACTGGTTGTTACTCAC 23 74 nCoV-2019_37_RIGHT Pool 1 GTCCACACTCTCCTAGCACCAT 22 75 nCoV-2019_38_LEFT Pool 2 ACTGTGTTATGTATGCATCAGCTGT 25 76 n

27、CoV-2019_38_RIGHT Pool 2 ATCATAAACACCAAGAGTCAGTCTAAA 25 DB32/T 3762.112020 6 序号 引物名称 所属引物池 引物序列（ 5-3） 长度 77 nCoV-2019_39_LEFT Pool 1 AGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTGGT 29 78 nCoV-2019_39_RIGHT Pool 1 TGTAACTGGACACATTGAGCCC 22 79 nCoV-2019_40_LEFT Pool 2 TGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAGT 26 80 nCoV-2019_40_RIGHT

28、 Pool 2 CATGGCTGCATCACGGTCAAAT 22 81 nCoV-2019_41_LEFT Pool 1 GTTCCCTTCCATCATATGCAGCT 23 82 nCoV-2019_41_RIGHT Pool 1 TGGTATGACAACCATTAGTTTGGCT 25 83 nCoV-2019_42_LEFT Pool 2 TGCAAGAGATGGTTGTGTTCCC 22 84 nCoV-2019_42_RIGHT Pool 2 CCTACCTCCCTTTGTTGTGTTGT 23 85 nCoV-2019_43_LEFT Pool 1 TACGACAGATGTCTT

29、GTGCTGC 22 86 nCoV-2019_43_RIGHT Pool 1 AGCAGCATCTACAGCAAAAGCA 22 87 nCoV-2019_44_LEFT Pool 2 TGCCACAGTACGTCTACAAGCT 22 88 nCoV-2019_44_RIGHT Pool 2 AACCTTTCCACATACCGCAGAC 22 89 nCoV-2019_45_LEFT Pool 1 TACCTACAACTTGTGCTAATGACCC 25 90 nCoV-2019_45_RIGHT Pool 1 AAATTGTTTCTTCATGTTGGTAGTTAGAGA 30 91 nC

30、oV-2019_46_LEFT Pool 2 TGTCGCTTCCAAGAAAAGGACG 22 92 nCoV-2019_46_RIGHT Pool 2 CACGTTCACCTAAGTTGGCGTA 22 93 nCoV-2019_47_LEFT Pool 1 AGGACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCC 28 94 nCoV-2019_47_RIGHT Pool 1 AATAACGGTCAAAGAGTTTTAACCTCTC 28 95 nCoV-2019_48_LEFT Pool 2 TGTTGACACTGACTTAACAAAGCCT 25 96 nCoV-2019_48_RI

31、GHT Pool 2 TAGATTACCAGAAGCAGCGTGC 22 97 nCoV-2019_49_LEFT Pool 1 AGGAATTACTTGTGTATGCTGCTGA 25 98 nCoV-2019_49_RIGHT Pool 1 TGACGATGACTTGGTTAGCATTAATACA 28 99 nCoV-2019_50_LEFT Pool 2 GTTGATAAGTACTTTGATTGTTACGATGGT 30 100 nCoV-2019_50_RIGHT Pool 2 TAACATGTTGTGCCAACCACCA 22 101 nCoV-2019_51_LEFT Pool

32、1 TCAATAGCCGCCACTAGAGGAG 22 102 nCoV-2019_51_RIGHT Pool 1 AGTGCATTAACATTGGCCGTGA 22 103 nCoV-2019_52_LEFT Pool 2 CATCAGGAGATGCCACAACTGC 22 104 nCoV-2019_52_RIGHT Pool 2 GTTGAGAGCAAAATTCATGAGGTCC 25 105 nCoV-2019_53_LEFT Pool 1 AGCAAAATGTTGGACTGAGACTGA 24 106 nCoV-2019_53_RIGHT Pool 1 AGCCTCATAAAACTC

33、AGGTTCCC 23 107 nCoV-2019_54_LEFT Pool 2 TGAGTTAACAGGACACATGTTAGACA 26 108 nCoV-2019_54_RIGHT Pool 2 AACCAAAAACTTGTCCATTAGCACA 25 109 nCoV-2019_55_LEFT Pool 1 ACTCAACTTTACTTAGGAGGTATGAGCT 28 110 nCoV-2019_55_RIGHT Pool 1 GGTGTACTCTCCTATTTGTACTTTACTGT 29 111 nCoV-2019_56_LEFT Pool 2 ACCTAGACCACCACTTA

34、ACCGA 22 112 nCoV-2019_56_RIGHT Pool 2 ACACTATGCGAGCAGAAGGGTA 22 113 nCoV-2019_57_LEFT Pool 1 ATTCTACACTCCAGGGACCACC 22 114 nCoV-2019_57_RIGHT Pool 1 GTAATTGAGCAGGGTCGCCAAT 22 115 nCoV-2019_58_LEFT Pool 2 TGATTTGAGTGTTGTCAATGCCAGA 25 116 nCoV-2019_58_RIGHT Pool 2 CTTTTCTCCAAGCAGGGTTACGT 23 117 nCoV-

35、2019_59_LEFT Pool 1 TCACGCATGATGTTTCATCTGCA 23 DB32/T 3762.112020 7 序号 引物名称 所属引物池 引物序列（ 5-3） 长度 118 nCoV-2019_59_RIGHT Pool 1 AAGAGTCCTGTTACATTTTCAGCTTG 26 119 nCoV-2019_60_LEFT Pool 2 TGATAGAGACCTTTATGACAAGTTGCA 27 120 nCoV-2019_60_RIGHT Pool 2 GGTACCAACAGCTTCTCTAGTAGC 24 121 nCoV-2019_61_LEFT Pool

36、 1 TGTTTATCACCCGCGAAGAAGC 22 122 nCoV-2019_61_RIGHT Pool 1 ATCACATAGACAACAGGTGCGC 22 123 nCoV-2019_62_LEFT Pool 2 GGCACATGGCTTTGAGTTGACA 22 124 nCoV-2019_62_RIGHT Pool 2 GTTGAACCTTTCTACAAGCCGC 22 125 nCoV-2019_63_LEFT Pool 1 TGTTAAGCGTGTTGACTGGACT 22 126 nCoV-2019_63_RIGHT Pool 1 ACAAACTGCCACCATCACA

37、ACC 22 127 nCoV-2019_64_LEFT Pool 2 TCGATAGATATCCTGCTAATTCCATTGT 28 128 nCoV-2019_64_RIGHT Pool 2 AGTCTTGTAAAAGTGTTCCAGAGGT 25 129 nCoV-2019_65_LEFT Pool 1 GCTGGCTTTAGCTTGTGGGTTT 22 130 nCoV-2019_65_RIGHT Pool 1 TGTCAGTCATAGAACAAACACCAATAGT 28 131 nCoV-2019_66_LEFT Pool 2 GGGTGTGGACATTGCTGCT 22 132

38、nCoV-2019_66_RIGHT Pool 2 TCAATTTCCATTTGACTCCTGGGT 24 133 nCoV-2019_67_LEFT Pool 1 GTTGTCCAACAATTACCTGAAACTTACT 28 134 nCoV-2019_67_RIGHT Pool 1 CAACCTTAGAAACTACAGATAAATCTTGGG 30 135 nCoV-2019_68_LEFT Pool 2 ACAGGTTCATCTAAGTGTGTGTGT 24 136 nCoV-2019_68_RIGHT Pool 2 CTCCTTTATCAGAACCAGCACCA 23 137 nCo

39、V-2019_69_LEFT Pool 1 TGTCGCAAAATATACTCAACTGTGTCA 27 138 nCoV-2019_69_RIGHT Pool 1 TCTTTATAGCCACGGAACCTCCA 23 139 nCoV-2019_70_LEFT Pool 2 ACAAAAGAAAATGACTCTAAAGAGGGTTT 29 140 nCoV-2019_70_RIGHT Pool 2 TGACCTTCTTTTAAAGACATAACAGCAG 28 141 nCoV-2019_71_LEFT Pool 1 ACAAATCCAATTCAGTTGTCTTCCTATTC 29 142

40、nCoV-2019_71_RIGHT Pool 1 TGGAAAAGAAAGGTAAGAACAAGTCCT 27 143 nCoV-2019_72_LEFT Pool 2 ACACGTGGTGTTTATTACCCTGAC 24 144 nCoV-2019_72_RIGHT Pool 2 ACTCTGAACTCACTTTCCATCCAAC 25 145 nCoV-2019_73_LEFT Pool 1 CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT 29 146 nCoV-2019_73_RIGHT Pool 1 CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA 22 147 nCoV-

41、2019_74_LEFT Pool 2 ACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGC 28 148 nCoV-2019_74_RIGHT Pool 2 GCAACACAGTTGCTGATTCTCTTC 24 149 nCoV-2019_75_LEFT Pool 1 AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGT 26 150 nCoV-2019_75_RIGHT Pool 1 ACCACCAACCTTAGAATCAAGATTGT 26 151 nCoV-2019_76_LEFT Pool 2 AGGGCAAACTGGAAAGATTGCT 22 152 nCoV-2019_76

42、_RIGHT Pool 2 TCTCTGCCAAATTGTTGGAAAGGCA 22 153 nCoV-2019_77_LEFT Pool 1 CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA 22 154 nCoV-2019_77_RIGHT Pool 1 CAGCCCCTATTAAACAGCCTGC 22 155 nCoV-2019_78_LEFT Pool 2 CAACTTACTCCTACTTGGCGTGT 23 156 nCoV-2019_78_RIGHT Pool 2 TGTGTACAAAAACTGCCATATTGCA 25 157 nCoV-2019_79_LEFT Pool 1 GT

43、GGTGATTCAACTGAATGCAGC 23 158 nCoV-2019_79_RIGHT Pool 1 CATTTCATCTGTGAGCAAAGGTGG 24 DB32/T 3762.112020 8 序号 引物名称 所属引物池 引物序列（ 5-3） 长度 159 nCoV-2019_80_LEFT Pool 2 TTGCCTTGGTGATATTGCTGCT 22 160 nCoV-2019_80_RIGHT Pool 2 TGGAGCTAAGTTGTTTAACAAGCG 24 161 nCoV-2019_81_LEFT Pool 1 GCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGG

44、25 162 nCoV-2019_81_RIGHT Pool 1 GTGAAGTTCTTTTCTTGTGCAGGG 24 163 nCoV-2019_82_LEFT Pool 2 GGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCT 25 164 nCoV-2019_82_RIGHT Pool 2 TGCCAGAGATGTCACCTAAATCAA 24 165 nCoV-2019_83_LEFT Pool 1 TCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCA 25 166 nCoV-2019_83_RIGHT Pool 1 TTTGACTCCTTTGAGCACTGGC 22 167 nCoV-

45、2019_84_LEFT Pool 2 TGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCT 22 168 nCoV-2019_84_RIGHT Pool 2 AGGTGTGAGTAAACTGTTACAAACAAC 27 169 nCoV-2019_85_LEFT Pool 1 ACTAGCACTCTCCAAGGGTGTT 22 170 nCoV-2019_85_RIGHT Pool 1 ACACAGTCTTTTACTCCAGATTCCC 25 171 nCoV-2019_86_LEFT Pool 2 TCAGGTGATGGCACAACAAGTC 22 172 nCoV-2019_86_RIGHT P

46、ool 2 ACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTACGC 25 173 nCoV-2019_87_LEFT Pool 1 CGACTACTAGCGTGCCTTTGTA 22 174 nCoV-2019_87_RIGHT Pool 1 ACTAGGTTCCATTGTTCAAGGAGC 24 175 nCoV-2019_88_LEFT Pool 2 CCATGGCAGATTCCAACGGTAC 22 176 nCoV-2019_88_RIGHT Pool 2 TGGTCAGAATAGTGCCATGGAGT 23 177 nCoV-2019_89_LEFT Pool 1 CGCGTACGCGT

47、TCCATGTGGTC 22 178 nCoV-2019_89_RIGHT Pool 1 ATAGTAACCTGAAAGTCAACGAGAT 25 179 nCoV-2019_90_LEFT Pool 2 ACACAGACCATTCCAGTAGCAGT 23 180 nCoV-2019_90_RIGHT Pool 2 TGAAATGGTGAATTGCCCTCGT 22 181 nCoV-2019_91_LEFT Pool 1 TCACTACCAAGAGTGTGTTAGAGGT 25 182 nCoV-2019_91_RIGHT Pool 1 TTCAAGTGAGAACCAAAAGATAATAA

48、GCA 29 183 nCoV-2019_92_LEFT Pool 2 TTTGTGCTTTTTAGCCTTTCTGCT 24 184 nCoV-2019_92_RIGHT Pool 2 AGGTTCCTGGCAATTAATTGTAAAAGG 27 185 nCoV-2019_93_LEFT Pool 1 TGAGGCTGGTTCTAAATCACCCA 23 186 nCoV-2019_93_RIGHT Pool 1 AGGTCTTCCTTGCCATGTTGAG 22 187 nCoV-2019_94_LEFT Pool 2 GGCCCCAAGGTTTACCCAATAA 22 188 nCoV

49、-2019_94_RIGHT Pool 2 TTTGGCAATGTTGTTCCTTGAGG 23 189 nCoV-2019_95_LEFT Pool 1 TGAGGGAGCCTTGAATACACCA 22 190 nCoV-2019_95_RIGHT Pool 1 CAGTACGTTTTTGCCGAGGCTT 22 191 nCoV-2019_96_LEFT Pool 2 GCCAACAACAACAAGGCCAAAC 22 192 nCoV-2019_96_RIGHT Pool 2 TAGGCTCTGTTGGTGGGAATGT 22 193 nCoV-2019_97_LEFT Pool 1 TGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGA 28 194 nCoV-2019_97_RIGHT Pool 1 ACACACTGATTAAAGATTGCTATGTGAG 28 195 nCoV-2019_98_LEFT Pool 2 AACAATTGCAACAATCCATGAGCA 24 196 nCoV-2019_98_RIG