DB32 T 3762.2-2020 新型冠状病毒检测技术规范 第2部分：病毒分离与鉴定.pdf

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1、ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.2 2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 2 部分 ： 病毒分离 与 鉴定 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 2: Virus isolation and identification 2020 - 03 - 02 发布 2020 - 03 - 03 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3762.22020 I 前 言 DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范 目前分为以下部分 ： 第 1部分：生物样本采集、

2、运输和保存 ； 第 2部分：病毒分离与鉴定； 第 3部分：核酸荧光 PCR检测程序； 第 4部分：重组酶介导等温扩增程序； 第 5部分：血清 IgM和 IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； 第 6部分：血清 IgM和 IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； 第 7部分：空气样 本 检测与评估； 第 8部分：物体表面检测与评估； 第 9部分：医务人员职业暴露检测与评估。 本部分为 DB32/T 3762 的第 2部分。 本部分按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术 委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科

3、大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本 部分 主要起草人： 迟莹、朱宝立、葛以跃、郭喜玲 、 崔仑标、 程军平、徐佳南、钱志远、罗晓明、 沈欢喜。 DB32/T 3762.22020 1 新型冠状病毒检测技术规范 第 2 部分 ： 病毒分离 与 鉴定 1 范围 本 部分 规定了 新型冠状病毒感 染临床 样本病毒分离培养 环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操 作步骤和清场与消毒 。 本 部分 适用于新型冠状病毒 感染患者各类临床样本中新型冠状病毒（ SARS-CoV-2） 的分离培养， 其它呼吸道病毒的 分离培养 程序可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对

4、于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国 国家卫生健康委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 细胞病变效应 cytopathic effect， CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引 起其显微表现改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为 多核细胞，细胞内出现包涵体 ，乃至 细胞裂解等即 细胞病变效应。 4 环境与设施 4.1 实验室资质及级别要求 ： 应

5、符合 新型冠状病毒实验室生物安全指南 的要求， 实验室开展新型 冠状病毒感染临床样本病毒分离培养相关活动前，应报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资 质 ， 并 需在生物安全三级（ BSL-3）实验室进行。 4.2 操作 人员 资质及 防护 要求 ： 实验操作 人员 应经过生物安全培训并取得 BSL-3 实验活动上岗证，在 身体健康状态良好的情况下准入 。操作人员 按 BSL-3 级 实验室个人防护的要求进行 防护 ，需配备 N95 及以上 级别 防护口罩、护目镜 或防护 面屏 、连体防护服、 一次性手术衣、 一次性 PE 手套、 乳胶手套、 鞋套、 靴套等 防护装备 。 5 设备 与耗

6、材 5.1 设备 生物安全柜、离心机、 倒置显微镜、涡旋器、 CO2培养箱 等。 DB32/T 3762.22020 2 5.2 耗材 一次性平皿、 剪刀、镊子、聚四氟乙烯研磨器（塑料）、离心管、 细胞培养瓶 /细胞管、移液器、 移液管、带滤芯 Tip头 等。 6 试剂与材料 6.1 临床样本 6.1.1 呼吸道样本 ： 咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等 。 6.1.2 尸体 解剖组织样 本 。 6.1.3 血液样本 ： 病人急性期血清。 6.2 试剂 6.2.1 Hanks 溶液（每毫升含青、链霉素各 2000 单位）。 6.2.2 DMEM 培养液（含 10%胎牛血清）。 6.2.3 DMEM

7、维持液（含 2%胎牛血清）。 6.2.4 消化液 （ 0.25%胰酶和 0.025% EDTA-Na2 混合液）。 6.3 细胞 非洲绿猴肾传代细胞（ VERO-E6） 、人肝癌细胞（ Huh7）等 。 7 操作步骤 7.1 实验前准备 7.1.1 将 实验所需 细胞置 37 5% CO2 培养箱培养至单层 。 7.1.2 配备消毒液： 75%酒精、 0.55%次氯酸钠消毒液。 7.1.3 检查 BSL-3 级实验室压力是否正常。 7.1.4 将细胞、样本、试剂和耗材一次性带入 BSL-3 级实验室核心区。 7.2 样 本处理 7.2.1 呼吸道 样 本 及肛拭子 a) 在 生物安全柜 内 涡

8、旋震荡 装有 呼吸道 样 本（咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等） 及肛拭子 的 采样 管 ， 瞬时离心后 取上清液 至 新的离心管，按 终浓度 10% 20%加入 青链霉素， 置 4 冰箱处理 样本 4-6 小时 或过夜 。 b) 将 上述处理过的样本 4 ， 4000rpm， 离心 5min，以去除杂质。 7.2.2 肺组织样 本 a) 在 生物安全柜 内将肺组织放在平皿内，取 3 mL 5mL 的 Hanks 溶液漂洗 3 次，以去除组织外 部的血垢。漂洗时动作要轻柔，防止气溶胶的产生和液体的溅出。漂洗的废液收集在含 0.55% 的次氯酸钠消毒液的带盖塑料瓶内。 b) 将漂洗后的肺组织，用无菌的

9、剪刀和镊子去除肺组织上的结缔组织和血管，再用 Hanks 溶液 漂洗 1 次，将肺组织剪成 1mm3 的小块放在研磨器内 进行研磨， 研磨的动作要轻柔，注意避免 DB32/T 3762.22020 3 液体的溅出。研磨后制成 20%悬液 ， 按终浓度 10% 20%加入青链霉素，置 4 冰箱处理样本 4-6 小时或过夜。 c) 将上述处理过的样本管 4 ， 4000rpm， 离心 5min，以去除杂质 。 7.2.3 血液样 本 a) 感染急性期血清，按终浓度 10% 20%加入青链霉素，置 4 冰箱处理样本 4 6 小时或过夜。 b) 将上述处理过的样本管 4 ， 4000rpm， 离心 5

10、min，以去除杂质。 7.3 接种病毒 7.3.1 弃去 VERO-E6 细胞培养液，用 Hanks 液洗涤细胞 3 次 ，弃上清。 7.3.2 吸取 50L 200L 样本液接种至培养孔内，轻轻混匀，置 37 5% CO2 培养箱，吸附 1h 2h， 期间每 15min 摇晃一次。 7.3.3 吸附后弃上清，补足适量 DMEM 维持液，置 37 5% CO2 培养箱培养，设 VERO E6 细胞对照 7.4 细胞 病变（ CPE）观察 与 培养物 收集 鉴定 7.4.1 细胞病变（ CPE）观察 按上述方法样本接种 细胞 后 ， 每 24h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（ CPE）：以 0%

11、 25%细胞 CPE变化为 “+”， 26% 50%细胞 CPE变化为 “+”， 51% 75%细胞 CPE变化为 “+”， 76% 100%细胞 CPE变化为 “+”， 正常细胞形态为 “-”。 7.4.2 培养物收集 每代次收集的 培养物 需 反复 冻融三次， 4 ， 4000rpm， 离心 15min，收集上清 。 7.4.3 培养 结果 鉴定 满足以下两点 判定 病毒分离成功。若不满足以下条件说明病毒分离不成功，需盲传三代或重新接种 临床样本再做鉴定。 a) 样本接种孔 细胞出现明显 CPE(+及以上 )； b) 分离培养物进行新型冠状病毒核酸检测 呈 阳性 。 8 清场与消毒 8.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用 75酒精擦拭外表面后，移出生物安全柜。 8.2 将实验过程产生 的 所有 污染材料 经 121 ， 30min 高压消毒灭菌 处理。 8.3 用新鲜配制的含 0.55次氯酸钠溶液擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面 ， 不要擦拭顶棚 ，作 用 30min 后，用清水擦拭以除去残余消毒液 。 8.4 填写实验记录并用 传真机传出，退出核心区 填写 BSL-3 级实验室相关实验记录 。 _