DB1307 T 300-2020 “张杂谷”品种分子鉴定技术规程.pdf

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1、 B22 张家口市地方标准 DB1307 DB1307/T 300 2020 “张杂谷”品种分子鉴定技术规程 2020-01-06 发布 2020-01-21 实施 张家口市 市场监督管理局 发布 DB1307/T 300 2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草 。 本标准由张家口市农业科学院提出。 本标准起草单位：张家口市农业科学院 、 北京市农林科学院、 河北巡天农业科技有限公司 。 本标准主要起草人： 赵治海 、 魏玮 、 李双东 、 范光宇 、 王凤格 、 赵久然 、 易红梅 、 王蕊 、 叶世峰 、 李素军 、 朱成平 、 刘粤阳 、 杨建勇 、 赵

2、芳 、 张晓磊 、 冯小磊 、 王晓明 、 王峰 、 史高雷 、 宋国亮 、 王德权 、 张雅莉 、 李欣儒 、 张文英 、 邱风仓 、 裴晶晶 。 DB1307/T 300 2020 1 “张杂谷”品种分子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了 采 用 微卫星标记 进行 “张杂 谷”品种分子鉴定 的 术语和定义 、 原理 、 仪器设备 、 试剂 及 溶液配制 、 引物信息 、 参照品种信息 、 操作程序 、 数据记录与统计 、 判定规则 等 技 术 要求 。 本标准适用于 “张杂谷”品种分子鉴定 。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 核心引物 品种鉴定 中 优先选用的一套

3、SSR（ simple sequence repeat） 引物，具有多态性高、重复性好等 特点 。 2.2 参照品种 所用 的 SSR 标记能够扩增出稳定、清晰、可辨的等位变异 的品种。参照品种用于 辅助确定待测样 品的 等位变异 ， 校正 实验操作、 仪器设备的系统误差 。 3 原理 由于不同 谷子 品种遗传组成不同，基因组 DNA中简单重复序列的重复次数 存在 差异，利用微卫星标 记技术 可 鉴定 不同 谷子 品种 及来源 。 4 仪器设备 仪器设备 见附录 A。 5 试剂及 溶液配制 试剂及 溶液配制 见附录 B。 6 引物信息 引物信息 核心引物名单及序列 表 见附录 C，核心引物等位

4、变异等相关信息见附录 D。 7 参照品种信息 参照品种信息 见附录 E。 DB1307/T 300 2020 2 8 操作程序 8.1 取样 送验样品 可为 种子 、 幼苗、叶片、果穗等 组织或器官 。 对 谷子 材料 随机数取至少 5个个体组成 混合 样品进行分析 。 8.2 DNA 提取 8.2.1 CTAB 提取法：幼苗或叶片约 200 mg 300 mg，置于 2.0 mL 离心管，加液氮 冷冻， 充分研磨，或 取种子充分磨碎，移入 2.0 mL 离心管；每管加入 700 L 65 预热的 CTAB 提取液后，充分混合， 65 保温 60 min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯

5、甲烷 /异戊醇混合液，充分混合后，静置 10 min； 12 000 rpm 离心 15 min，取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次， -20 放置 30 min； 4 ， 12 000 rpm 离心 10 min，弃上清液；加入 70%乙醇，旋转离 心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立 于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀 6 h 以上；加入 100 L 超纯水或 TE 缓冲液，充分溶解后备用。 8.2.2 也可使用 其它达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法。 8.3 PCR 扩增 8.3.1 引物选择 首先选择 附录 C中 第 118对引物 进行检测，当样品间检测出的差异

6、位点数小于 2时，再选用附录 C中 第 1936对引物 进行检测。 8.3.2 反应体系 各组分的 终浓度如下： 每种 dNTP 0.10 mmol/L， 上游、下游 引物各 0.24 mol/L， Taq DNA聚合酶 0.04 U/l， 1倍 PCR缓冲液（含 Mg2+ 2.5 mmol/L）， DNA浓度 2.5ng/l，其余以超纯水补足至所需体积。 8.3.3 反应程序 94 预变性 5 min， 1个循环； 94 变性 40 s， 60 退火 35 s， 72 延伸 45 s，共 35个循环； 72 延 伸 10 min， 4 保存。 8.4 PCR 产物检测 8.4.1 变性聚丙烯

7、酰胺凝胶电泳 （ PAGE） 法 8.4.1.1 清洗玻璃板 用清水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍， 95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂 上 0.5 mL 亲和硅烷工作液，带凹槽的 短板上涂 0.5 mL 剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互 相污染。 8.4.1.2 灌胶 在 100 mL 4.5% PAGE胶中加入 TEMED和 25%过硫酸铵各 100 L，迅 速混匀后灌胶。待胶流动到下 部，在上部轻轻的插入梳子，使其聚合 1h以上。灌胶时应匀速防止出现气泡。 8.4.1.3 预电泳 在正极槽（下槽）中加入 1倍 TBE缓冲液 600 mL，在负极槽（上槽）加入预热

8、至 65 的 1倍 TBE缓冲 液 600 mL，拔出梳子。 90W恒功率预电泳 1020 min。 DB1307/T 300 2020 3 8.4.1.4 变性 在 20L PCR产物 中加入 4 L 6倍 加样缓冲液 ， 混匀后，在 PCR仪上运行变性程序： 95 变性 5 min， 4 冷却 10 min以上。 8.4.1.5 电泳 用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入 5 l 样品。 80W 恒功 率电泳至上部的指示带（二甲苯青 FF）到达胶板的中部。电泳结束后， 分开两块玻璃板。 注： 预期扩增产物片段大小在 150 bp以下时电泳时间应适当缩短，扩增产

9、物片段大小在 300 bp以上时电泳时间应适 当延长。 8.4.1.6 银染 银染按以下步骤进行： a） 固定：固定液中轻轻晃动 3 min； b）漂洗：双蒸水快速漂洗 1 次，不超过 10 s； c）染色：染色液中染色 5 min； d）漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过 10 s； e）显影：显影液中轻轻晃动至带纹出现； f）定影：固定液中定影 5 min； g）漂洗：双蒸水漂洗 1 min。 8.4.2 荧光标记毛细管电泳 8.4.2.1 样品制备 等体积混合 不同荧光 SSR标记 （ FAM， ROX） 扩 增产物，混匀后从混合液中吸取 1 L加入到 DNA 分析仪专用 96孔板孔中。板

10、中各孔分别加入 0.1 L分子量内标和 8.9 L去离子甲酰胺。将样品在 PCR仪 上 95 变性 5 min，取出，立即置于碎冰上，冷却 10 min以上。离心 10 s后置放到 DNA分析仪上。 8.4.2.2 电泳检测 按照仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程 序 ，保存数据。 9 数据记录与统计 9.1 数据记录 对普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将每个扩增位点的等位变异与参照品种的等位变异片段大小进行 比较，确定样品在该位点的等位变异；对荧光标记毛细管电泳，通过参照品种消除同型号不同批次间或 不同型号 DNA 分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取样品在该位点的等位变异。 纯合

11、位点的基因型数据记录为 X/X，杂合位点的基因型数据记录为 X/Y，其中 X、 Y 分别为该位点 上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为 0/0。 示例 1： 样品在某个位点上仅出现一个等位变异，为 150，在该位点的基因型记录为 150/150； 示例 2： 样品在某个位点上有两个等位变异，分别为 150、 160，在该位点的基因型记录为 150/160。 9.2 数据统计 当对送验样品混合 DNA 进行分析时，可直接进行品种间成对比较，如果样品某个引物位点出现可 DB1307/T 300 2020 4 见的异质性且影响到差异位点判定时，可重新提取至少 20

12、 个个体的 DNA， 并用该引物重新扩增，统计 在该引物位点上不同个体的基因型（或等位变异）及所占比例。当对送检样品多个个体 DNA 进行分析 时，应统计其在各引物位点的各种基因型（或等位变异）及所占比例。对单交种，应比较两个样品在各 引物位点的基因型；对自交系，应比较两个样品在各引物位点的等位变异。 成对比较的数据统计记录表见附录 F。 10 判定规则 10.1 结果判定 当样品间差异位点数 2，判定为 “ 不同 ” ； 当样品间差异位点数 1，判定为 “ 近似 ” ；当样品间 差异位点数 0，判定为 “ 极近似或相同 ” 。 对利用附录 C中 36对引物仍未检测到 2个差异位点数的样品，如

13、果相关品种存在特定标记，必要时 增加其特定标记进行检测。 10.2 结果表述 比较位点数： ，比较位点为： ；差异位点数： ，差异位点为： ；判 定为： 。 DB1307/T 300 2020 5 A A 附 录 A （规范性附录） 主要仪器设备及试剂 A.1 主要仪器设备 A.1.1 PCR扩增仪 A.1.2 高压电泳仪 规格为 3000V、 400mA、 400W，具有恒电压、恒电流和恒功率功能。 A.1.3 垂直电泳槽及配套的制胶附件 A.1.4 普通电泳仪 A.1.5 水平电泳槽及配套的制胶附件 A.1.6 高速冷冻离心机 最大离心力不小于 15 000 rpm， -10 30 。 A

14、.1.7 水平摇床 A.1.8 胶片观察灯 A.1.9 电子天平 感应为 0.01 g、 0.001 g。 A.1.10 微量移液器 规格分别为 10 L、 20 L、 100 L、 200 L、 1000 L，连续可调。 A.1.11 磁力搅拌器 A.1.12 紫外分光光度计 波长 260 nm 及 280 nm。 A.1.13 微波炉 A.1.14 高压灭菌锅 A.1.15 酸度计 A.1.16 水浴锅或金属浴 控温精度 1 。 A.1.17 冰箱 最低温度 -20 。 DB1307/T 300 2020 6 A.1.18 制冰机 A.1.19 凝胶成像系统或紫外透射仪 A.1.20 DN

15、A分析仪 基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨 1个核苷酸大小的差异。 DB1307/T 300 2020 7 B B 附 录 B （规范性附录） 溶液配制 B.1 主要试剂 B.1.1 十六烷基三乙基溴化铵（ CTAB） B.1.2 三氯甲烷 B.1.3 异丙醇 B.1.4 异戊醇 B.1.5 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na22H2O） B.1.6 三羟甲基氨基甲烷（ Tris-base） B.1.7 盐酸 （ HCI）： 37 % B.1.8 氢氧化钠（ NaOH） B.1.9 氯化钠 (NaCl) B.1.10 10倍 PCR Buffer缓冲液 含 Mg2+ 25

16、 mmol/L B.1.11 四种脱氧核苷三磷酸 dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP（每种 10 mmol/L） B.1.12 Taq DNA聚合酶 B.1.13 矿物油 B.1.14 琼脂糖 B.1.15 DNA分子量标准 B.1.16 核酸染色剂 B.1.17 去离子甲酰胺 B.1.18 溴酚蓝 B.1.19 二甲苯青 FF B.1.20 甲叉双丙烯酰胺 B.1.21 丙烯酰胺 B.1.22 硼酸 DB1307/T 300 2020 8 B.1.23 尿素 B.1.24 亲和硅烷 B.1.25 剥离硅烷 B.1.26 无水乙醇 B.1.27 四甲基乙二胺 B.1.28 过硫酸铵

17、B.1.29 冰醋酸 B.1.30 乙酸铵 B.1.31 硝酸银 B.1.32 甲醛 B.1.33 DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液 B.1.34 DNA分析仪专用分子量内标 Liz标记 B.1.35 DNA分析仪专用电泳缓冲液 B.2 DNA提取溶液的配制 B.2.1 0.5 mol/L EDTA溶液 称取 186.1 g Na2EDTA.2H2O溶于 800 mL水中， 加 固体 氢氧化钠 调 pH值至 8.0，定容至 1000 mL，高 压灭菌。 B.2.2 1 mol/L Tris-HCl溶液 称取 60.55 g Tris碱溶于水中，加 HCl调 pH至 8.0，定容至 500 mL，高

18、压灭菌。 B.2.3 0.5 mol/L 盐酸 溶液 量取 25 mL浓盐酸，加水定容至 500 mL。 B.2.4 CTAB提取液 称取 81.7g 氯化钠和 20g CTAB溶于适量水中，加入 1 mol/L Tris-HCl 100 mL， 0.5 mol/L EDTA 40 mL，定容至 1000 mL， 4 贮存。 B.2.5 TE缓冲液 量取 1 mol/L Tris-HCl 5mL， 0.5 mol/L EDTA 1mL，加 盐酸 调 pH至 8.0，定容至 500 mL。 B.2.6 5 mol/L 氯化钠 溶液 称取 146 g 固体 氯化钠 溶于水中， 定容至 500 mL

19、。 B.3 PCR扩增溶液的配制 DB1307/T 300 2020 9 B.3.1 dNTP 量取 超纯水分别配制 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGPT终浓度 100 mmol/L的储存液 ， 各取 20 L混合， 加 超纯水 720 L定容至 每种 终浓度 2.5 mmol/L工作液。 B.3.2 SSR引物 量取 超纯水分别配制 上游 引物和 下游 引物终浓度均 40 mol/L的储存液，等体积混合成 20 mol/L工 作液。 注： 干粉配制前应首先快速离心。 B.3.3 6倍 加样缓冲液 量取 去离子甲酰胺 49 mL， 0.5 mol/L的 EDTA溶液（ pH8.0） 1

20、 mL， 加 溴酚兰 0.125 g，二甲苯青 0.125 g。 B.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 B.4.1 40 PAGE胶 称取 丙烯酰胺 190 g和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 10 g， 定 容 至 500 mL。 B.4.2 4.5% PAGE胶 称取 尿素 450 g， 量取 10倍 TBE缓冲液 100 mL， 40% PAGE胶 112.5 mL，定容至 1000 mL。 B.4.3 Bind缓冲液 量取 49.75 mL无水乙醇 ， 250 L冰醋酸 ，混匀 。 B.4.4 亲和硅烷工作液 量取 1 mL Bind缓冲液 ， 加入 5 L Bind原液，混匀。 B

21、.4.5 剥离硅烷工作液 2% 二甲基二氯硅烷。 B.4.6 25%过硫酸铵溶液 称取 0.25 g过硫酸铵 溶于 1 mL超纯水 。 B.4.7 10倍 TBE缓冲液 称取 Tris碱 108 g，硼酸 55 g， 量取 0.5 mol/L EDTA溶液 37 mL，定容至 1000 mL。 B.4.8 1倍 TBE缓冲液 量取 10倍 TBE缓冲液 500 mL，加水定容至 5000 mL。 B.5 银染溶液的配制 B.5.1 固定液 量取 100 mL冰醋酸，加水定容至 1000 mL。 DB1307/T 300 2020 10 B.5.2 染色液 称取 2 g硝酸银，加水定容至 100

22、0 mL。 B.5.3 显影液 1000 mL蒸 馏 水 中 加 入 30 g 氢 氧 化 钠 和 5 mL甲醛。 C DB1307/T 300 2020 11 附 录 C （规范性附录） 核心引物名单及序列 表 表 C.1 规定了核心引物 名称及序列。 表 C.1 核心引物名单及序列 表 编号 引物名称 引物序列 P01 MI 32 上游： GGTAACCAACCAGCGCATTGC 下游： GCGTTCTCGAACTTGCACTCTC P02 MI 34 上游： GCGGCGGGAATGGTTGATG 下游： GAAGCCGTGGCACCAAAGC P03 MI 35 上游： AGCTGC

23、AACCTGTCTTGAGAGC 下游： GCAGAAGTGGCCGCGACAG P04 MI 28 上游： TCCTCCTACACGGGCAGACC 下游： AGCTCGGGGCAGCGATAAAC P05 MI 40 上游： CAGGCTCTGCCGAGGAACG 下游： CACGCGGTGGCAAAAGAACTC P06 MI 50 上游： GCAAGTCGGATGCGATAGCC 下游： CGTGGGTGGGCATCTATGATCG P07 MI 36 上游： GAACGCTGAACCCTACCCTCTC 下游： AGGTCTGGGCTACGGGCTAC P08 MI 10 上游： C

24、TCGCGTATATGGCTCCAAGTG 下游： GAGTCGCCGTCGCATGGTC P09 MI 47 上游： AACGCCAACTCACCAACACAAG 下游： AGGAGCAAGACGTGGAGCATG P10 MI 54 上游： CGACTGGGTCTCTAGCCACCAC 下游： CCTTGCCACCCTTCGGACTAAC P11 MI 03 上游： TCGGATGGGCAGACGAGAGG 下游： CACACACCGCCAAGGCAAAG P12 MI 02 上游： GCTCAGCGCCCAGTTCGAC 下游： AAAGAAGAGCGGTTTGCGTGAC P13 MI

25、 63 上游： AAGAAGAGCGGAGTAGCTTGCG 下游： TCAGACACACTGGGCCTAATGC P14 MI 37 上游： TTCCTGCCGCGCTTTCTCG 下游： CGGAGAATTACTGCCCGAGGAG P15 MI 31 上游： CCTGCCCTCTGTCCCTGTATTC 下游： TTTAGGAGGCGGCATTTTGGTG P16 MI 27 上游： ACAACGCATGGACTGTGATCG 下游： TGTTGTACTGCAACGCCGAAAG P17 MI 18 上游： CCGTCGTGGGAAGCAGTGC 下游： AGACTCGGTTTCGCCA

26、ATTTGC P18 MI 61 上游： ACTGGACTGTAAGCACAAGTGC 下游： CTTTGACAGTTCAGGCGGGTTG P19 MI 12 上游： GCCGCGCAAACCCCTAAAC 下游： CGGGGAAGTCGAGCACCTC P20 MI 44 上游： CGAAAGCACAGGTACCCTTGTC 下游： CAGCCCCTCCGTCTTTGCC DB1307/T 300 2020 12 表 C.1 核心引物名单及序列表 （续） 编号 引物名称 引物序列 P21 MI 38 上游： GCGCAACATAGTCCCGAAAATG 下游： TACCTGGACATCCC

27、TGCTCTCG P22 MI 06 上游： GGTGGGCGGAATCCTGATGAAC 下游： TTCACCCCGGCATAAGTTCAGG P23 MI 59 上游： CGGCAAGCGTGGTGTCCTAG 下游： ACTCTGGCGAGGAAAGGATGC P24 MI 14 上游： CACTGCGAGTATTGCGTGTGC 下游： TTGCTCATGGAAACGGTCACTG P25 MI 25 上游： CGATCATCCCGTTCCTTGCATG 下游： CAAGAGCCCAGAGGTCCTGTAC P26 MI 20 上游： AACCAATGCGGCTGCAAACG 下游：

28、TTGGGTTCGGTCCGCTCATTC P27 MI 62 上游： TCGCCCCGTCCATTTCGTG 下游： CGAATTCCTGCGAGCTGACATG P28 MI 07 上游： GGTGTGCTGGTGAACGCATAGG 下游： TCGGTCGCGTGTTGGCTTG P29 MI 19 上游： GCTGTCATGTCGATCTGATGGC 下游： GGCCAATTGCGATTCGTCCAG P30 MI 41 上游： CCACTCTGCAACCCACTCTCC 下游： CCAGAATGGGCCGCTCACC P31 MI 42 上游： ACGTCAAGGCTTCCGTCTG

29、TC 下游： CCGCCACAGCGCGTTAATTAG P32 MI 04 上游： TCAGAGCCCGAATCATCGCTAC 下游： ACTCTAGGGAGGGAGCCTTCTC P33 MI 08 上游： GTTTGCCGGTATGTGACGTTGC 下游： GCTCGCAGCATCCGAAGGTG P34 MI 17 上游： CAGTCGGATGGGTCGCTGTC 下游： TCCAATGGAGACCACGGCAATC P35 MI 22 上游： CGACATCAGACGGGGATTGGG 下游： TCAGCTCGTTACATTGGTTGCG P36 MI 57 上游： GGAATG

30、TTGCCCTGTGCTTGAG 下游： GCCACCCACATCCTTTGCAG D DB1307/T 300 2020 13 附 录 D （资料性附录） 核心引物 扩增产物 相关信息 表 D.1 规定了核心引物扩 增产物相关信息。 表 D.1 核心引物 扩增 产物 相关信息 表 引物编号 引物名称 等位变异范围 (bp) 等位变异 (bp) 参照品种名称 参照品种基因型 P01 MI 32 273-293 273 小黄谷 273/285 279 张杂谷 3 号 279/285 282 蒜皮白 282/285 285 农大 8 号 285/293 288 124 父本 279/288 290

31、 洋谷子 273/290 293 晋谷 29 号 293/293 P02 MI 34 178-189 178 金香玉 178/186 179 A2 179/179 184 盖叶红 184/186 185 坝谷 257 185/187 186 南二沙 186/188 187 晋谷 40 号 179/187 188 大金苗 178/188 189 蒜皮白 179/189 P03 MI 35 262-294 262 张杂谷 16 号 262/285 268 ISE375 268/268 271 张杂谷 12 号 271/285 274 八斗子 274/291 277 齐头黄 277/277 279

32、张杂谷 10 号 279/285 283 A52 271/283 285 张杂谷 19 号 285/291 288 124 父本 288/288 291 大同 29 291/291 294 豫谷 18 294/294 P04 MI 28 235-257 235 金香玉 235/235 236 张杂谷 20 号 236/237 237 张杂谷 19 号 237/238 238 DH3 238/238 243 小乌谷子 243/243 256 ISE375 256/256 257 张杂谷 12 号 237/257 P05 MI 40 202-212 202 坝谷 257 202/206 DB130

33、7/T 300 2020 14 表 D.1 核心引物 扩增产物 相关信息 表（续） 203 花脸 203/203 206 DH2 206/206 209 陇谷 11 号 209/209 210 张杂谷 16 号父本 210/210 212 小鸡了 212/212 P06 MI 50 270-276 270 ISE120 270/270 272 长杂 2 号 272/274 274 张杂谷 22 号 274/276 276 A2 276/276 P07 MI 36 246-253 246 张杂谷 6 号 246/252 247 18 沙 619 247/247 252 张杂 谷 16 号 父本

34、252/252 253 Y117 253/253 P08 MI 10 162-176 162 压破车 162/166 166 齐头黄 166/173 169 ISE1541 169/169 173 毛毛谷 173/173 176 蒜皮白 166/176 P09 MI 47 253-287 253 冀谷 41 253/253 263 张杂谷 6 号 263/271 265 8311 265/265 267 张杂谷 3 号 267/271 269 大金苗 269/277 271 张杂谷 19 号 271/281 273 花脸 273/273 275 会宁凉谷 275/275 277 豫谷 18 2

35、77/277 279 龙爪谷 279/279 281 DH2 281/281 283 ISE120 283/283 285 金香玉 285/285 287 南二沙 253/287 P10 MI 54 274-292 272 ISE1541 272/284 274 124 父本 274/274 278 洋谷子 278/288 282 ISE120 182/282 284 张杂谷 10 号 284/288 286 张杂谷 3 号 286/288 287 齐 01 287/287 288 大金苗 288/290 DB1307/T 300 2020 15 表 D.1 核心引物 扩增产物 相关信息 表（

36、续） 290 冀谷 41 290/290 292 张杂谷 22 号父本 292/292 294 3422 294/294 P11 MI 03 156-162 156 济谷 19 号 156/162 159 ISE1541 159/162 162 张杂谷 20 号父本 162/162 P12 MI 02 161-172 161 农大 8 号 161/164 164 张杂谷 18 号 164/167 167 张杂谷 13 号 167/170 170 张杂谷 22 号父本 170/170 172 张杂谷 19 号 167/172 P13 MI 63 250-261 250 A2 250/250 25

37、1 承 11-272 251/251 252 18 沙 720 252/252 253 张杂谷 10 号 250/253 261 张杂谷 6 号 250/261 P14 MI 37 199-213 199 蒙龙香谷 2 号 199/199 200 长 杂 2 号 200/200 201 张杂谷 22 号 201/213 213 8311 213/213 P15 MI 31 220-284 220 张杂谷 12 号 220/235 235 农大 8 号 235/237 237 鸟不叼毛谷 220/237 239 毛毛谷 239/239 242 六十天还仓 242/242 244 老头谷 244/

38、244 247 会宁凉谷 247/247 253 大金苗 253/253 255 小鸡了 255/255 260 大粒黄 260/260 265 张杂谷 22 号父本 220/265 272 18JX2410 272/272 273 陇谷 11 号 273/275 275 黑谷 275/275 281 蒙龙金谷 255/281 284 大同 29 284/284 P16 MI 27 229-245 229 盖叶红 229/233 233 大金苗 233/238 234 ISE120 234/234 237 张杂谷 3 号 233/237 DB1307/T 300 2020 16 表 D.1 核

39、心引物 扩增产物 相关信息 表（续） 238 大粒黄 238/238 245 乌谷 245/245 P17 MI 18 161-230 161 ISE1541 161/161 163 张杂谷 22 号父本 163/163 167 盖叶红 167/169 169 A2 169/169 184 红苗 184/184 204 2176 204/211 205 藁城谷 205/205 209 湘西糯 209/209 211 2176 204/211 228 124 父本 169/228 230 18JX4210 169/230 P18 MI 61 180-202 180 张杂谷 22 号父本 180/

40、200 198 承 11-272 198/198 200 张杂谷 16 号父本 200/200 202 小青谷 202/202 P19 MI 12 199-204 199 盖叶红 199/202 200 张杂谷 6 号 200/203 202 ISE120 202/202 203 A2 203/203 204 晋红 102 204/204 P20 MI 44 238-242 238 红苗小白粒 238/238 239 张杂谷 3 号 239/242 241 18 沙 619 241/241 242 A2 242/242 P21 MI 38 175-185 175 张杂谷 10 号 175/17

41、8 176 ISE1541 176/181 178 晋谷 29 号 178/180 179 小急谷 179/179 180 豫谷 18 180/180 181 张杂谷 6 号 175/181 185 ISE120 185/185 P22 MI 06 218-224 218 A2 218/218 224 豫谷 18 224/224 P23 MI 59 198-210 198 张杂谷 20 号 198/207 207 张杂谷 3 号 207/210 210 DH2 210/210 P24 MI 14 205-221 205 蒙龙金谷 205/205 206 A2 206/206 DB1307/T

42、300 2020 17 表 D.1 核心引物 扩增产物 相关信息 表（续） 207 ISE375 207/207 210 张杂谷 24 号父本 210/210 211 灰谷 211/213 212 张杂谷 10 号 212/212 213 大青苗 213/213 214 鲁谷 10 号 214/214 215 龙爪谷 215/215 218 DH2 218/218 219 金点玉 219/219 221 老绳头 221/221 P25 MI 25 236-244 236 毛毛谷 236/236 237 张杂 谷 18 号 237/238 238 豫谷 18 238/238 239 张杂谷 22

43、 号 239/239 240 老绳头 240/240 242 花脸 242/242 244 盖叶红 244/244 P26 MI 20 198-215 198 张杂谷 12 号 198/207 201 大头蝇 201/201 204 盖叶红 204/207 205 张杂谷 16 号 205/207 207 A2 207/207 209 大青苗 209/209 212 陇谷 11 号 212/212 215 ISE120 215/215 P27 MI 62 232-234 232 张杂谷 3 号 232/234 234 张杂谷 20 号父本 234/234 P28 MI 07 171-178 1

44、71 张杂谷 10 号 176/197 178 A2 178/178 P29 MI 19 285-329 285 大金苗 285/325 325 张杂谷 18 号 325/329 326 张杂谷 10 号 326/329 329 张杂谷 3 号 285/329 P30 MI 41 179-195 179 张杂谷 12 号 179/191 181 ISE1541 181/192 188 鸟不叼毛谷 188/188 191 A2 191/191 192 小青谷 192/195 193 黑谷 179/193 195 刀把齐 195/195 DB1307/T 300 2020 18 表 D.1 核心引

45、物 扩增产物 相关信息 表（续） P31 MI 42 273-276 273 A2 273/273 276 ISE375 273/276 P32 MI 04 233-237 233 ISE1541 233/237 234 张杂谷 10 号 234/237 237 A2 237/237 P33 MI 08 187-197 187 蒜皮白 187/192 192 张杂谷 6 号 192/197 196 小黄谷 196/196 197 大金苗 187/197 P34 MI 17 220-229 220 张杂谷 10 号 220/225 225 张杂谷 22 号父本 225/225 229 大同 29

46、 229/229 P35 MI 22 152-162 152 鸟不叼毛谷 152/162 159 ISE1541 159/166 162 张杂谷 19 号 159/162 163 湘西糯 163/163 166 124 父本 166/166 P36 MI 57 242-252 242 蒙龙香谷 2 号 242/242 243 长杂 2 号 243/243 244 张杂谷 12 号 244/252 252 DH2 252/252 注 1： 附录 D 中提供的等位变异包括了至今在审定和品 种权保护已知品种中检测到的所有等位变异，今后对于附录 D 中未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和对应

47、参照品种后再补充发布 。 注 2： 每个引物位点上提供的参照品种包含了该位点最大、最小和 等位基因频率大 于 0.05 的等 位变异， 且 每间隔一 个等位变异至少提供一个参照品种。逐位点进行电泳检测时可从中选择使用部分或全部参照品种。 DB1307/T 300 2020 19 附 录 E （资料性附录） 参照品种名单及来源 表 E.1 规定了 参照品种名单及来源 。 表 E.1 参照品种名单及来源 编号 品种名称 分组 编号 品种名称 分组 R01 A2 核心 R21 8311 扩展 R02 张杂谷 3 号 核心 R22 湘西糯 扩展 R03 张杂谷 6 号 核心 R23 豫谷 18 扩展

48、R04 张杂谷 10 号 核心 R24 大同 29 扩展 R05 张杂谷 12 号 核心 R25 冀谷 41 扩展 R06 张杂谷 13 号 核心 R26 长杂 2 号 扩展 R07 张杂谷 16 号 核心 R27 坝谷 257 扩展 R08 张杂谷 18 号 核心 R28 晋谷 29 号 扩展 R09 张杂谷 19 号 核心 R29 晋谷 40 号 扩展 R10 张杂谷 20 号 核心 R30 陇谷 11 号 扩展 R11 张杂谷 22 号 核心 R31 济谷 19 号 扩展 R12 张杂谷 24 号 核心 R32 齐 01 扩展 R13 124 父本 核心 R33 花脸 扩展 R14 DH2 核心 R34 盖叶红 扩展 R15 DH3 核心 R35 金香玉 扩展 R16 ISE120 核心 R36 洋谷子 扩展 R17 ISE375 核心 R37 毛毛谷 扩展 R18 ISE1541 核心 R38 龙爪谷 扩展 R19 蒜皮白 核心 R39 齐头黄 扩展 R20 大金苗 核心 R40 南二沙 扩展 注 1： 同一名称不同来源的参照品种在某一位点上的等位变异可能不相同，如果使用了同名的其它来源的参照品种， 应与原参照品种核对，确认无误后使用。 注 2： 多个品种在 某一 SSR位点上可能具有相同的等位变异，在确认这些品种