DIN 10344-2015 Milk and milk products - Determination of lactose and D-galactose content - Enzymatic method《奶和奶制品 乳糖和D-半乳糖含量的测定 酶法》.pdf

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1、Mai 2015DEUTSCHE NORM DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)Preisgruppe 7DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.01!%AY/“230

2、5412www.din.deDDIN 10344Milch und Milcherzeugnisse Bestimmung des Lactose- und D-Galactosegehalts Enzymatisches VerfahrenMilk and milk products Determination of lactose and D-galactose content Enzymatic methodLait et produits laitiers Dtermination de la lactose et de la D-galactose Mthode enzymatiqu

3、eAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10344:1982-08www.beuth.deGesamtumfang 10 SeitenDIN 10344:2015-05 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen 4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Chemikalien 4 4.1 Allgemeines 4 4.2 Zinksulfat-Lsung 4 4.3 K

4、aliumhexacyanoferrat(II)-Lsung, .4 4.4 Natronlauge, .4 4.5 Schwefelsure, .4 4.6 Citrat-Pufferlsung 5 4.7 Kaliumdiphosphat-Pufferlsung 5 4.8 Nicotinamid-adenin-dinucleotid(NAD)-Lsung, .5 4.9 -Galactosidase-Suspension, .5 4.10 -Galactose-Dehydrogenase-Suspension, .5 5 Gerte 5 5.1 Analysenwaage, .5 5.2

5、 Pipetten, 5 5.3 Messkolben, .6 5.4 Faltenfilter, 6 5.5 Spektralphotometer, 6 5.6 Messkvetten, 6 6 Probenahme .6 7 Durchfhrung .6 7.1 Probenvorbereitung.6 7.2 Herstellung der Probenlsung .6 7.3 Enzymatische Bestimmung 7 8 Auswertung 7 8.1 Berechnung 7 8.2 Angabe der Untersuchungsergebnisse 8 8.3 Wie

6、derholprzision 8 8.4 Vergleichprzision .8 9 Untersuchungsbericht 9 Anhang A (informativ) Ergebnisse des Ringversuchs . 10 DIN 10344:2015-05 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 057-05-13 AA Milch und Milcherzeugnisse Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ im DIN-Normenausschuss Lebens

7、mittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. Das DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. nderungen Gegenber DIN 10344:1982

8、-08 wurden folgenden nderungen vorgenommen: a) Chemikalienliste aktualisiert und ergnzt; b) Abschnitt Begriffe“ gestrichen; c) Berechnungsfaktor fr Lactose-Monohydrat gendert; d) Angaben zur geforderten Przision des Verfahrens hinzugefgt; e) Norm technisch und redaktionell berarbeitet und ergnzt und

9、 damit an die derzeit gltigen Gestaltungs-regeln angepasst. Frhere Ausgaben DIN 10344: 1982-08 DIN 10344:2015-05 4 1 Anwendungsbereich Dieses Dokument legt ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an Lactose und D-Galactose in Milch und Milcherzeugnissen fest. Das Verfahren ist auch b

10、ei Anwesenheit anderer Zucker anwendbar. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweis

11、ungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milcherzeugnisse Leitfaden zur Probenahme 3 Kurzbeschreibung In dem von Fett und Eiwei befreiten, wssrigen Extrakt der Probe wird Lactose durch das Enzym -Galactosidase zu D-Glu

12、cose und D-Galactose gespalten. D-Galactose wird in Gegenwart des Enzyms Galactose-Dehydrogenase durch Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) zu Galactonsure oxidiert. Die Menge der bei dieser Reaktion gebildeten reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH) wird durch Messung des Extink

13、tionsanstiegs in der Probenlsung bei 340 nm bestimmt und ist der vorhandenen D-Galactose proportional. In einem Parallelansatz wird die vorhandene freie D-Galactose ohne Spaltung der Lactose in gleicher Weise durch Oxidation zu D-Galactonsure bestimmt. Die Differenz der Extinktionen zwischen der Pro

14、benlsung, die mit -Galactosidase behandelt wurde, und der Probenlsung ohne Spaltung der Lactose ist proportional der aus Lactose freigesetzten D-Galactose und somit auch dem Lactosegehalt der Probe. 4 Chemikalien 4.1 Allgemeines Sofern nicht anders angegeben, sind analysenreine Chemikalien zu verwen

15、den. Das fr die Probenlsung verwendete Wasser muss mindestens die Reinheit von destilliertem Wasser haben. Zur Herstellung der Enzymlsungen ist frisch bidestilliertes Wasser zu verwenden. 4.2 Zinksulfat-Lsung Massenkonzentration (ZnSO47H2O) = 300 g/l 4.3 Kaliumhexacyanoferrat(II)-Lsung, (K4Fe(CN)63H

16、2O) = 150 g/l 15 g Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat werden mit Wasser zu 100 ml gelst. 4.4 Natronlauge, Stoffmengenkonzentration c(NaOH) = 0,1 mol/l 4.5 Schwefelsure, c(H2SO4) = 2 mol/l DIN 10344:2015-05 5 4.6 Citrat-Pufferlsung 2,8 g Trinatriumcitrat-Dihydrat (C6H5Na3O72 H2O), 625 mg Magnesiumsu

17、lfat-Heptahydrat (MgSO4 7 H2O) und 42 mg Citronensure (C6H8O7) werden mit 40 ml bidestilliertem Wasser gelst. Der pH-Wert sollte 6,6 betragen und wird gegebenenfalls mit einigen Tropfen Schwefelsure (4.5) oder Natronlauge (4.4) eingestellt. Mit bidestilliertem Wasser wird auf 50 ml aufgefllt. Die Ls

18、ung ist bei 4 C drei Monate haltbar. 4.7 Kaliumdiphosphat-Pufferlsung 8,3 g Kaliumpyrophosphat (Kaliumdiphosphat) tetrabasisch (K4P2O7) werden in 40 ml bidestilliertem Wasser gelst, mit Schwefelsure (4.5) wird der pH-Wert auf 8,6 eingestellt. Anschlieend wird mit Wasser auf 50 ml aufgefllt. Die Lsun

19、g ist bei 4 C zwei Monate haltbar. 4.8 Nicotinamid-adenin-dinucleotid(NAD)-Lsung, 35 mg NAD (C21H27N7O14P2) werden in 7 ml Citrat-Pufferlsung (4.6) gelst. Die Lsung ist bei 4 C mindestens drei Wochen haltbar. 4.9 -Galactosidase-Suspension, aus E.coli, (EC 3.2.1.23); Kristallsuspension, (-Galactosida

20、se) = 5 mg/ml in Ammoniumsulfatlsung (c(NH4)2SO4) = 3,2 mol/l), spezifische Aktivitt (25 C) etwa 30 U/mg1). Die Suspension ist bei 4 C 12 Monate haltbar. 4.10 -Galactose-Dehydrogenase-Suspension, aus Pseudomonas fluorescens, (EC 1.1.1.48); Suspension, (Gal-DH) = 5 mg/ml in Ammoniumsulfatlsung (c(NH4

21、)2SO4) = 3,2 mol/l), spezifische Aktivitt (25 C) etwa 5 U/mg1). Die Suspension ist bei 4 C 12 Monate haltbar. ANMERKUNG Fr die enzymatische Bestimmung befinden sich Fertigreagenzien im Handel, bei deren Verwendung die Arbeitsvorschrift der Prparatehersteller zu bercksichtigen ist. 5 Gerte 5.1 Analys

22、enwaage, Skalenteilung 0,1 mg. 5.2 Pipetten, zur enzymatischen Analyse geeignet, Nennvolumen 2 ml variabel, 1 ml, 100 l und 20 l. 1)1 U (1 Unit) ist die Enzymmenge, die bei einer Temperatur von 25 C unter definierten Bedingungen eine Substratmenge von 1 mol Substrat je min umsetzt.DIN 10344:2015-05

23、6 5.3 Messkolben, Nennvolumen 100 ml. 5.4 Faltenfilter, Nenndurchmesser 150 mm. 5.5 Spektralphotometer, geeignet zum Messen bei 340 nm. ANMERKUNG Es knnen auch Spektralphotometer, die eine Messung bei 365 nm bzw. 334 nm (Hg-Lampen) gestatten, verwendet werden. Die Extinktionskoeffizienten fr NADH (s

24、iehe 8.1) betragen dann 3,4 l mmol1 cm1 bzw. 6,18 l mmol1 cm1. 5.6 Messkvetten, aus Glas oder Kunststoff, Schichtdicke 10,0 mm. 6 Probenahme Nach DIN EN ISO 707. 7 Durchfhrung 7.1 Probenvorbereitung Die Probe wird vor der Untersuchung gut durchgemischt, um eine reprsentative Untersuchungsprobe zu er

25、halten. 7.2 Herstellung der Probenlsung 7.2.1 Etwa 1 g der Probe wird auf 0,1 mg eingewogen und in den Messkolben (5.3) gebracht. Pastse Proben werden in einer Reibschale mit Wasser vermengt und mit wenig Wasser in den Messkolben (5.3) bergesplt. 50 ml Wasser werden zugegeben und mit der Probe gut v

26、ermischt. Die Lactosekonzentration im Filtrat nach 7.2.3 sollte zwischen 0,05 g/l und 1 g/l liegen; sind grere oder kleinere Lactosemengen zu erwarten, ist das Verhltnis der Einwaage zur Gre des Messkolbens entsprechend zu whlen. 7.2.2 1 ml der Kaliumhexacyanoferrat(II)-Lsung (4.3) und 1 ml der Zink

27、sulfat-Lsung (4.2) werden nacheinander hinzugegeben. Nach jeder Zugabe wird krftig durchgeschttelt. Die Mischung wird mit Natronlauge (4.4) gegen Indikatorpapier neutralisiert. Mit Wasser wird bis zur Marke aufgefllt, der Kolbeninhalt durchgeschttelt und 15 min lang stehen gelassen. Es drfen auch kl

28、einere Mengen bzw. niedrigere Konzentrationen der Fllungsreagenzien nach 4.2 und 4.3 verwendet werden, sofern sich klare Filtrate bei der Filtration ergeben (siehe 7.2.3). 7.2.3 Der Kolbeninhalt wird durch ein trockenes Faltenfilter (5.4) filtriert. Falls erforderlich, wird nochmals filtriert, bis s

29、ich ein klares Filtrat ergibt. DIN 10344:2015-05 7 7.3 Enzymatische Bestimmung Die Bestimmung ist bei etwa 20 C durchzufhren. Die Blindwert-, D-Galactose- und Lactosebestimmungen werden parallel durchgefhrt. Die Mengen der Zugaben der einzelnen Lsungen bzw. Suspensionen, sowie der Ablauf der Bestimm

30、ung sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 1 Blindwert-, Lactose- und D-GalactosebestimmungLactose-BestimmungaD-Galactose-BestimmungbIn Kvetten pipettieren Blindwert Probenlsung Blindwert Probenlsung NAD-Lsung (4.8)-Galactosidase-Suspension (4.9) Probenlsung (7.2) 0,200 ml 0,020 ml - 0,200 ml 0,02

31、0 ml 0,100 ml 0,200 ml - - 0,200 ml - 0,100 ml mischen, 20 min bei 20 C bis 25 C stehen lassen. Zugabe von Kaliumdiphosphat-Pufferlsung (4.7) bidestilliertes Wasser 1,000 ml 2,000 ml 1,000 ml 1,900 ml 1,000 ml 2,020 ml 1,000 ml 1,920 ml mischen, nach etwa 2 min Extinktionen der Lsungen gegen Luft me

32、ssen (E1). Reaktion starten durch Zugabe von -Galactose-Dehydrogenase-Suspension (4.10) 0,020 ml 0,020 ml 0,020 ml 0,020 ml mischen, Stillstand der Reaktion abwarten (etwa 15 min bei 50 g Lactose/Messansatz; etwa 30 min bei 200 g Lactose/Messansatz) und Extinktionen der Lsungen gegen Luft messen (E2

33、). Falls die Reaktion nach der angegebenen Zeit nicht zum Stillstand gekommen ist, Extinktionen weiter in 5 min Abstnden messen, bis eine konstante Extinktionsnderung je 5 min erreicht ist. aDiese Bestimmung erfasst die freie und die in der Lactose gebundene D-Galactose. bEs wird nur die freie D-Gal

34、actose erfasst. Diese Bestimmung kann entfallen, wenn keine freie D-Galactose in der Probe vorhanden ist. Die gemessene Extinktionsdifferenz sollte zur Erzielung eines ausreichend przisen Ergebnisses in der Regel mindestens 0,100 Extinktionseinheiten betragen. 8 Auswertung 8.1 Berechnung Es werden f

35、olgende Extinktionsdifferenzen berechnet: EG= (E2 E1)Probe (E2 E1)Leerwert(1) ELG= (E2 E1)Probe (E2 E1)Leerwert(2) Die durch die Hydrolyse der Lactose verursachte Extinktionsnderung wird nach Gleichung (3) berechnet: EL= (ELG EG) (3) Der Lactosegehalt, wL, in g/100 g der Probe wird nach Gleichung (4

36、) berechnet: mVdVVMEw=2431LLL10(4) DIN 10344:2015-05 8 Dabei ist EGdie Extinktionsnderung, die durch freie Galactose verursacht wurde; ELGdie Extinktionsnderung, die durch freie Galactose und hydrolysierte Lactose verursacht wurde; ELdie Extinktionsnderung, die durch die Hydrolyse der Lactose verurs

37、acht wurde; MLdie molare Masse der wasserfreien Lactose, ML= 342,30 g/mol, bzw. fr -Lactose-Monohydrat ML= 360,31 g/mol (der Gehalt an -Lactose-Monohydrat wird durch Multiplikation des Gehaltes an wasserfreier Lactose mit dem Faktor 1,052 6 erhalten); der molare Extinktionskoeffizient von NADH bei 3

38、40 nm, = 6,30 (l mmol1 cm1); d die Schichtdicke in cm; in diesem Fall ist d = 1,00 cm; V1das Volumen des Messansatzes in ml (in diesem Fall ist V1= 3,240 ml); V2das Volumen der Probenlsung im Messansatz in ml (in diesem Fall ist V2= 0,100 ml); V3das Volumen, auf das die Probe nach 7.2.2 aufgefllt wu

39、rde, in ml (in diesem Fall ist V3= 100 ml); m die Einwaage der Probe in g. Der D-Galactosegehalt, wG, in g/100 g der Probe wird nach Gleichung (5) berechnet: mVdVVMEw=2431GGG10(5) Dabei ist EGdie Extinktionsnderung (siehe oben); MGdie molare Masse der D-Galactose, MG= 180,16 g/mol. Die Bedeutung der

40、 anderen Symbole ist die gleiche wie bei der Berechnung der Lactose. 8.2 Angabe der Untersuchungsergebnisse Die Untersuchungsergebnisse werden auf zwei Dezimalstellen angegeben. 8.3 Wiederholprzision Die Differenz der Ergebnisse von zwei Bestimmungen, die zur gleichen Zeit oder unmittelbar nacheinan

41、der von demselben Untersucher durchgefhrt werden, darf rLactose= 0,05 wL(bei Lactose) bzw. rD-Galactose= 0,10 wG(bei D-Galactose) nicht berschreiten. 8.4 Vergleichprzision Durch zwei Laboratorien mitgeteilte Untersuchungsergebnisse an identischem Untersuchungsmaterial drfen sich bei blicher und korr

42、ekter Anwendung des Untersuchungsverfahrens um nicht mehr als RLactose= 0,06 wL(bei Lactose) bzw. RD-Galactose= 0,12 wG(bei D-Galactose) unterscheiden. DIN 10344:2015-05 9 9 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsbericht sind mindestens anzugeben: a) angewendetes Untersuchungsverfahren unter Verweisun

43、g auf diese Norm; b) Art der Probe; c) Art und Datum der Probenahme; d) Lactosegehalt (wasserfrei) in g/100 g der Probe bzw. Lactosemonohydratgehalt in g/100 g der Probe; e) D-Galactosegehalt in g/100 g der Probe; f) Untersuchungsdatum; g) Begrndung, falls von dieser Norm abgewichen worden ist. DIN

44、10344:2015-05 10 Anhang A (informativ) Ergebnisse des Ringversuchs Im Jahr 1982 wurde durch das ehemalige Bundesinstitut fr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinrmedizin“ (BgVV) ein Ringversuch zur Ermittlung der Przisionsdaten durchgefhrt. Die Ergebnisse dieses Ringversuchs sind in Tabelle

45、 A.1 angegeben. Tabelle A.1 Ergebnisse des Ringversuchs Matrix x (g/100 g) r (g/100 g) R (g/100 g) Lactose H-Vollmilch 4,5 0,26 0,26 H-Fruchtvollmilch 4,139 0,217 0,241 Molkenpulver 69,26 3,395 3,642 Schmelzkse-Zubereitung 5,272 0,291 0,267 D-Galactose Molkenpulver 1,035 0,077 0,100 Schmelzkse-Zubereitung 0,096 0,012 4 0,0131