DIN 10335-2010 Milk and milk products except milk powder - Determination of L- and D-lactic acid (L- and D-lactate) content - Enzymatic method《除奶粉外的牛奶和乳制品 L-和D-乳酸(L-和D-乳酸盐)含量的测定 酶催.pdf

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1、September 2010DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.01!$

2、al2“1627315www.din.deDDIN 10335Milch und Milcherzeugnisse ausgenommen Milchpulver Bestimmung des Gehaltes an L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) Enzymatisches VerfahrenMilk and milk products except milk powder Determination of L- and D-lactic acid (L- and D-lactat) content Enzymatic methodLait et p

3、roduits laitiers exempt lait en poudre Dtermination de la teneur en L- et D-acide lactique (L- et D-lactate) Mthode enzymatiqueAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10335:1987-06www.beuth.deGesamtumfang 13 SeitenDIN 10335:2010-09 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendun

4、gsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Begriffe .4 4 Kurzbeschreibung .4 5 Chemikalien5 6 Gerte6 7 Probenahme .6 8 Durchfhrung.6 8.1 Allgemeines6 8.2 Vorbereiten der Proben.7 8.3 Herstellen der Probenlsung7 8.4 Bestimmung .8 9 Auswertung 9 9.1 Berechnung9 9.2 Przision des Verfahrens. 10 10 Untersu

5、chungsbericht . 12 Literaturhinweise . 13 2 DIN 10335:2010-09 Vorwort Diese Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 057-05-13 AA Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ im Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte erarbeitet. nderungen Gegenber DIN 10335:1987-0

6、6 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) Titel und Anwendungsbereich auf Milch und alle Milchprodukte, ausgenommen Milchpulver, erweitert; b) anstelle des photometrischen Verfahrens ein enzymatisches Verfahren festgelegt; c) Norm technisch und redaktionell berarbeitet und ergnzt und damit an die

7、derzeit gltigen Gestaltungs-regeln angepasst. Frhere Ausgaben DIN 10335: 1977-06, 1984-01, 1987-06 3 DIN 10335:2010-09 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) in Milch und Milcherzeugnissen, ausgenommen Milch

8、pulver, fest. ANMERKUNG Fr Milchpulver kann das in DIN EN ISO 8069 beschriebene Verfahren angewendet werden. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatie

9、rten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milchprodukte Leitfaden zur Probenahme 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 Gehalt an D- und L-Milchsure (D- und L-Lactat) der

10、 nach dem in dieser Norm beschriebenen Verfahren bestimmte Gehalt an Milchsure, getrennt nach L- und D-Form ANMERKUNG Er wird als Massenanteil an L- und D-Milchsure in mg je 100 g der Probe angegeben. 4 Kurzbeschreibung In dem durch Carrez-Fllung von Fett und Eiwei befreiten wssrigen Extrakt der Pro

11、be wird Milchsure (L- und D-Form) durch Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) in Gegenwart der Enzyme L-Lactat-Dehydro-genase (L-LDH) und D-Lactat-Dehydrogenase (D-LDH) zu Brenztraubensure (Pyruvat) oxidiert. Die Menge der bei diesen Reaktionen gebildeten reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinuc

12、leotids (NADH) wird durch Messung des Extinktionsanstiegs der Probenlsung bei 340 nm (Hg 334 nm, Hg 365 nm) bestimmt und ist der vorhandenen L-Milchsure bzw. D-Milchsure proportional. Das Gleichgewicht dieser Reaktionen liegt weitgehend auf der Seite von Milchsure. Es wird durch Abfangen der Brenztr

13、aubensure mithilfe der Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) in Gegenwart von Glutaminsure und bei pH = 10 auf die Seite von Brenztraubensure und NADH verschoben. Die in einer Kvette ablaufenden Reaktionen laufen nach folgendem Reaktionsschema ab: L-Lactat + NAD+Pyruvat + NADH + H+(1) LDHLD-Lactat + N

14、AD+Pyruvat + NADH + H+(2) LDHDPyruvat + L-Glutamat L-Alanin + -Ketoglutarat (3) 10pHGPTDie Enzyme L-Lactat-Dehydrogenase und D-Lactat-Dehydrogenase sind stereospezifisch, sodass die beiden isomeren Milchsuren nacheinander oder nebeneinander bestimmt werden knnen. 4 DIN 10335:2010-09 5 Chemikalien 5.

15、1 Allgemeines Das verwendete Wasser muss bidestilliert oder mindestens von gleicher Reinheit sein. 5.2 Kaliumhexancyanoferrat(II)-Lsung, Massenkonzentration (K4Fe(CN)6 3H2O) = 36 g/l 3,60 g Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat werden mit Wasser zu 100 ml gelst. 5.3 Zinksulfat-Lsung, (ZnSO4 7 H2O) = 7

16、2 g/l 7,2 g Zinksulfat-Heptahydrat werden mit Wasser zu 100 ml gelst. 5.4 Natronlauge, Stoffmengenkonzentration c(NaOH) = 2 mol/l 8 g Natriumhydroxid werden mit Wasser zu 100 ml gelst. 5.5 Glycylglycin-Pufferlsung, pH = 10,0 7,92 g Glycylglycin (C4H8N2O3) und 1,47 g L-Glutaminsure (C5H9NO4) werden m

17、it etwa 80 ml Wasser gelst. Mit Natronlauge (5.4) wird der pH-Wert von 10,0 0,1 eingestellt. Die Lsung wird quantitativ in einen 100-ml-Messkolben bergefhrt und mit Wasser bis zur Marke aufgefllt. Die Lsung ist bei 4 C drei Monate haltbar. 5.6 Nicotinamid-adenin-dinucleotid-Lsung (NAD) 210 mg NAD (-

18、NAD H2O, lyophilisierte freie Sure, Massenanteil w 98 %) werden mit 6 ml bidestilliertem Wasser gelst. Die Lsung ist bei 4 C vier Wochen haltbar. 5.7 Glutamat-Pyruvat-Transaminase-Suspension (GPT) aus Schweineherz (EC 2.6.1.2), (GPT) = 10 mg/ml in Ammoniumsulfat-Lsung c(NH4)2SO4) = 3,2 mol/l, spezif

19、ische Aktivitt (25 C) etwa 80 U/mg1)Die Suspension ist bei 4 C ein Jahr haltbar. 5.8 L-Lactat-Dehydrogenase-Lsung (L-LDH) aus Schweinemuskel (EC 1.1.1.27), (L-LDH) = 10 mg/ml in Glycerollsung, (C3H8O3) = 50 g/100 ml, spezifische Aktivitt (25 C) etwa 550 U/mg)Die Lsung ist bei 4 C ein Jahr haltbar. 5

20、.9 D-Lactat-Dehydrogenase-Suspension (D-LDH) aus Lactobacillus leichmannii (EC 1.1.1.28), (D-LDH) = 5 mg/ml, in Ammoniumsulfat-Lsung c(NH4)2SO4) = 3,2 mol/l, spezifische Aktivitt (25 C) etwa 300 U/mg1)Die Suspension ist bei 4 C ein Jahr haltbar. ANMERKUNG Es befinden sich Fertig-Reagenzien im Handel

21、, bei deren Verwendung die Arbeitsvorschriften der Hersteller zu bercksichtigen sind. 1) 1 U (1 Unit) ist die Enzymmenge, die bei einer Temperatur von 25 C unter definierten Bedingungen eine Substrat-menge von 1 mol Substrat je min umsetzt.5 DIN 10335:2010-09 6 Gerte 6.1 Analysenwaage, Skalenteilung

22、swert 0,1 mg. 6.2 Spektralphotometer, geeignet zur Messung bei 340 nm. ANMERKUNG Es knnen auch Filterphotometer mit Hg-Lampe, die eine Messung bei 365 nm bzw. 334 nm gestatten, verwendet werden. Die Extinktionskoeffizienten fr NADH (siehe 9.1) betragen dann 3,4 l mmol1 cm1bzw. 6,18 l mmol1 cm1. 6.3

23、Messkvetten aus Glas oder Kunststoff, Schichtdicke d = 1,000 cm geeignet fr ein Messvolumen von 2,29 ml. 6.4 Eisbad, Khlschrank. 6.5 Faltenfilter, Nenndurchmesser 150 mm, mittelschnell filtrierend. 6.6 Reagenzglser, Durchmesser 25 mm, Lnge 250 mm. 6.7 Becherglas oder Erlenmeyerkolben, Nennvolumen 10

24、0 ml. 6.8 Messkolben, Nennvolumen 100 ml. 6.9 Pipetten, zur enzymatischen Analyse geeignet, Nennvolumen 1 ml, 200 l, 20 l, z. B. nach DIN 12699. 6.10 pH-Messeinrichtung mit Elektroden, bestehend aus einem pH-Messgert mit Messunsicherheit von 0,01 pH-Einheiten, sowie Glaselektrode und Bezugselektrode

25、 (z. B. Kalomelelektrode). Falls kein Temperaturpotentiometer vorhanden ist, muss das Gert fr Messungen bei 20 C geeignet sein. ANMERKUNG Glas- und Bezugselektrode knnen auch als Kombinationselektrode (Einstabmesskette) zusammen-gefasst sein. 6.11 Magnetrhrgert oder anderer geeigneter Rhrer. 6.12 Ge

26、rt zum Zerkleinern von Kse, z. B. Haushaltsmixer. 6.13 Gert zum Homogenisieren der Probenlsung von Kse, z. B. Ultra Turrax2). 7 Probenahme Nach DIN EN ISO 707. 8 Durchfhrung 8.1 Allgemeines Whrend der Durchfhrung der Untersuchung muss jegliche Verunreinigung der Probe, insbesondere durch Speichel un

27、d Schwei, vermieden werden, da die Hautoberflche Milchsure enthlt. Pipettenspitzen drfen nicht mit den Hnden berhrt werden. 2) Ultra Turrax ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung dies

28、es genannten Produktes durch DIN. 6 DIN 10335:2010-09 8.2 Vorbereiten der Proben 8.2.1 Milch Die Milchprobe wird sorgfltig durchmischt. 8.2.2 Saure Milcherzeugnisse Khl gelagerte Proben werden auf Raumtemperatur gebracht. Die Packung wird unmittelbar vor dem Wgen geffnet und die Probe sorgfltig durc

29、hmischt. Anschlieend wird die Bestimmung unverzglich durchgefhrt. 8.2.3 Kse und Erzeugnisse aus Kse Vor der Analyse wird die Rinde, die schmierige Auenseite oder die Schimmel-Oberflchenschicht des Kses so entfernt, dass eine Untersuchungsprobe erhalten wird, die fr den Kse im blichen Verzehrzustand

30、reprsentativ ist. Die Untersuchungsprobe wird mittels eines geeigneten Gertes (6.12) zerkleinert. Hartkse und halbfeste Kse werden vorab vorzugsweise in Wrfel von etwa 15 mm Kantenlnge geschnitten. Die Wrfel werden durch Schtteln in einem Gef gemischt. Die Untersuchungsprobe wird dann wie oben angeg

31、eben zerkleinert. Die zerkleinerte Probe wird schnell durchmischt und, wenn es bei halbfesten und Hartksen erforderlich ist, ein zweites Mal zerkleinert und erneut grndlich durchmischt. Kseproben, die nicht wie oben beschrieben zerkleinert werden knnen, werden durch intensives Kneten grndlich durchm

32、ischt. Die Untersuchungsprobe wird bis zum Beginn der Untersuchung in einem luftdichten Gef gelagert. Whrend der gesamten Probenvorbereitung ist ein Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden. 8.2.4 Andere Milchprodukte Andere Milchprodukte werden nach ihrem Charakter in Anlehnung an eines der vorgenannten P

33、rodukte vorbereitet. 8.3 Herstellen der Probenlsung 8.3.1 Die Probenmenge bzw. Verdnnung wird so gewhlt, dass die Milchsurekonzentration in der Probenlsung zwischen 0,06 g/l und 0,35 g/l (Messung bei 365 nm) bzw. 0,03 g/l und 0,2 g/l (Messung bei 340 nm, 334 nm) liegt. Folgende Einwaagen werden empf

34、ohlen: Milch 5,0 g; Joghurt, Sauermilchprodukte 0,5 g bis 1,0 g; Molkenpulver, Kse 0,5 g. Die entsprechenden Mengen der nach 8.2 vorbereiteten Proben werden mglichst schnell auf 1 mg in einen 100-ml-Erlenmeyerkolben (6.7) eingewogen. Die Proben nach 8.2.1 und 8.2.2 werden mit etwa 50 ml heiem Wasser

35、 (60 C) versetzt und gut durchmischt. 7 DIN 10335:2010-09 Kseproben nach 8.2.3 werden mit etwa 30 ml heiem Wasser (etwa 55 C) versetzt. Die Probenlsung wird mit dem Homogenisiergert (6.13) etwa 1 min bzw. bis zur homogenen Verteilung der Probe gemixt. Am Homogenisiergert (6.13) anhaftende Probenrest

36、e werden mit etwa 20 ml Wasser vollstndig in den Erlenmeyerkolben (6.7) bergefhrt. Der Erlenmeyerkolben wird verschlossen und 15 min geschttelt oder auf dem Magnetrhrer gerhrt. 8.3.2 Nach dem Abkhlen werden nacheinander 5,0 ml Kaliumhexacyanoferrat(II)-Lsung (5.2) und 5,0 ml Zinksulfat-Lsung (5.3) h

37、inzugegeben. Nach jeder Zugabe wird krftig geschttelt. ANMERKUNG Wahlweise kann anstelle des Schttelns mit dem Magnetrhrer (6.11) gerhrt werden. 8.3.3 Anschlieend wird die Mischung mit der Natronlauge (5.4) auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 eingestellt. 8.3.4 Die Mischung wird in einen 100-ml-M

38、esskolben quantitativ bergesplt. Anschlieend wird der Messkolben bei 20 C mit Wasser aufgefllt. ANMERKUNG Bei Probenlsungen von Kse wird der Messkolben zur Fettabscheidung fr 15 min khl gestellt (6.4). 8.3.5 Hiernach wird der Inhalt des Messkolbens durch ein Faltenfilter (6.5) filtriert. Falls erfor

39、derlich, wird nochmals filtriert, bis sich ein klares Filtrat ergibt. Das klare Filtrat wird als Probenlsung zur Bestimmung nach 8.4 weiter verwendet. Die Probenlsung sollte unverzglich nach ihrer Herstellung zur Bestimmung nach 8.4 eingesetzt werden. ANMERKUNG 1 Schwache Trbungen stren die Bestimmu

40、ngen in der Regel nicht. ANMERKUNG 2 Je nach Konzentration an L- und D-Milchsure in der Probe (z. B. Joghurt) kann eine Verdnnung der nach 8.3.5 hergestellten Probenlsung erforderlich sein. Der Verdnnungsfaktor F ist in diesem Fall bei der Berechnung entsprechend zu bercksichtigen. 8.4 Bestimmung Di

41、e Bestimmung ist bei etwa 20 C durchzufhren. Die Mengen der Zugabe der einzelnen Lsungen bzw. Suspensionen sowie der Ablauf der Bestimmung sind Tabelle 1 zu entnehmen. Bei Serienanalysen ist nur ein Leerwert je Serie erforderlich. Die Extinktionszunahme (E2 E1) bzw. (E3 E2) der Messlsung sollte zwis

42、chen 0,1 und 0,5 (Messung bei 365 nm) bzw. zwischen 0,1 und 0,8 (Messung bei 340 nm bzw. 334 nm) liegen. Bei einer hheren Extinktionsdifferenz muss die Probenlsung verdnnt werden. In diesem Fall ist der Verdnnungsfaktor (F) bei der Berechnung zu bercksichtigen. Ist die Extinktions-differenz zu niedr

43、ig, kann das Probenvolumen (V2) bis auf 1 000 l erhht werden, dann wird die Wassermenge entsprechend verringert. Folgende Probenvolumina (V2) werden empfohlen: Saure Milchprodukte 100 l, andere Produkte 500 l. 8 DIN 10335:2010-09 Tabelle 1 Pipettierschema In Kvetten pipettieren Leerwert Probe Glycyl

44、glycin-Pufferlsung (5.5) 1,000 ml 1,000 ml NAD-Lsung (5.6) 0,200 ml 0,200 ml GPT-Suspension (5.7) 0,020 ml 0,020 ml Probenlsung (8.3.5) 0,100 ml bidestilliertes Wasser 1,000 ml 0,900 ml Mischen, nach etwa 5 min Extinktionen der Lsungen gegen Luft (keine Kvette im Strahlengang) messen (E1), dann Reak

45、tion starten durch Zugabe von D-LDH-Suspension (5.9) 0,050 ml 0,050 ml Mischen, nach Ablauf der Reaktion (etwa 30 min) Extinktionen von Leerwert und Probe unmittelbar nacheinander gegen Luft messen (E2), dann Zugabe von L-LDH-Lsung (5.8) 0,020 ml 0,020 ml Mischen, nach Ablauf der Reaktion (etwa 30 m

46、in) Extinktionen von Leerwert und Probe unmittelbar nacheinander gegen Luft messen (E3). Zuerst wird die Milchsure-Form (D oder L) gemessen, die in der geringeren Konzentration in der Proben-lsung vorliegt. Bei der Berechnung der Ergebnisse sind dann die entsprechenden Gesamtvolumina (V1) zu bercksi

47、chtigen. ANMERKUNG 1 Soll lediglich die Summe aus L- und D-Lactat bestimmt werden, so sind abweichend vom Pipettierschema die L- und D-Lactat-Dehydrogenase (5.8) und (5.9) unmittelbar nacheinander in die Leerwertkvette und die Probenkvette zu pipettieren. Die Messung der Extinktion E2erfasst die Sum

48、me der Stereoisomeren, damit entfllt die Messung E3. ANMERKUNG 2 Die Bestimmung der stereoisomeren Formen der Milchsure kann auch nebeneinander erfolgen, d. h. in verschiedenen Anstzen, wenn das Verhltnis L-zu-D-Milchsure bzw. umgekehrt, grer ist als z. B. 5:1. In diesem Fall ist die Probenlsung so herzustellen, dass bei der Bestimmung eine ausreichend hohe Extinktionsdifferenz (z. B. 0,100) gemessen wird, um ausreichend przise Ergebnisse zu erhalten. Alternativ kann die Probenlsung verdnnt oder das Probevolumen entsprechend erhht werden. Bei der Verwendung von Test-Kombinati