第七章 免疫分析与印迹技术.ppt

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1、第七章 免疫分析与印迹技术,免疫（immunity）是人类和脊椎动物最重要的防御机制，它是生物进化过程中逐步发展并完善起来的。免疫系统能在分子水平上识别“自我”和“非我”（外物），然后破坏那些被鉴定为非我的实体。免疫系统以这种方式消灭病毒、细菌等病原以及对生物体造成威胁的大分子。,近年来，由于免疫生物学的发展，新的免疫理论、技术与方法不断涌现，抗原、抗体与免疫大分子的结构与功能研究取得重大进展。利用免疫应答(response)过程进行免疫诊断和治疗的实验技术日趋成熟。通过抗原与抗体之间的特异性反应，对抗原或抗体进行量或质的免疫分析方法得到了长足发展。,免疫反应最大的特点就是高度的特异性，即抗体

2、对抗原的特异性识别。其中专一性可超过酶对底物的识别水平。由于动物的免疫应答系统可被称为“抗原”的外源性物质激活而有针对性地产生“抗体”一类的蛋白质，免疫系统简直可以被认为是产生特异性试剂的合成机器，为人们提供了取之不竭的特异分析试剂。,此外，抗原与抗体的特异性不仅可在体内进行，还可在体外进行，这使免疫分析技术的应用远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为一类微量、灵敏、快速的检测方法，对疾病的诊断、疗效评价、预后判断和防治有着极其重要的意义。本章着重介绍抗原抗体反应的基本原理、免疫分析方法及与免疫分析具有类似识别机制的分子印迹和分子识体技术。,7. 1 抗原抗体反应的基本原理,7. 1

3、. 1 抗原与抗体抗原是一类能够刺激动物机体的免疫系统，诱导机体发生免疫应答，产生体液免疫的抗体和（或）细胞免疫的效应淋巴细胞，并在体内外与之发生特异反应的物质。,抗原的分类方法有很多，现主要依据抗原的来源分类，包括天然抗原、人工抗原和合成抗原三类。天然抗原是指自然界存在的细胞、细菌、病毒、蛋白质、核酸、多糖和结合蛋白；人工抗原是指通过人工合成的方法，将半抗原（有机小分子）结合到蛋白质上形成的完全抗原或是经人工化学改造的天然抗原；合成抗原是化学合成的分子，如多肽类抗原。,抗体是动物机体被入侵的抗原刺激后，在被抗原刺激的免疫应答中由B淋巴细胞分化的浆细胞产生的一类糖蛋白。抗体能与抗原发生特异性结

4、合，产生各种免疫效应的球蛋白分子或“免疫球蛋白”，以Ig表示。抗体是体液免疫的效应分子，是由免疫系统中的B淋巴细胞产生，以分泌形式分布于血液和组织液中或结合在B淋巴细胞膜上作为抗原的受体。,在血清或血浆凝固后，析出的黄色液体称为血清，抗原免疫后的动物血清中含有大量能与相应抗原结合的抗体分子，称为抗血清。血清蛋白质经电泳分离后显现出不同的迁移率，如图7.1所示。依次为白蛋白，、球蛋白等4个主要部分，抗体活性存在于从到这一广泛区域。,图7.1 血清蛋白电泳 图7.2 IgG的分子结构示意图,免疫球蛋白具有相似的结构，其基本结构（Ig单体）均由四条（两对）多肽链，即两条相同的重链（H链）和两条相同的

5、轻链（L链）借链间的二硫键连接组成，其中的糖基存在于重链上。 H链分子量相对较大，约为50000 Da，由440570个氨基酸残基组成。L链分子量约为25000 Da，由214个氨基酸残基组成。整个Ig分子单体是Y型，如图7.2所示。,对人而言，根据重链恒定区氨基酸组成和排列顺序（即抗原特异性）的不同，可将Ig重链分为五类，分别以、与表示。因此免疫球蛋白相应地分为IgG（），IgM（），IgA（），IgD（）和IgE（）五类，它们的相对分子量分别为1.6105，1.0106，1.5105，1.8105和2.0105，分别占血清免疫球蛋白的75，10，15，0.2和0.002。,IgD在血清中的

6、含量很低，约有2310-2 mg mL-1，半衰期只有3天。它在调节抗体的反应中发挥作用，是B细胞成熟的标志。IgE在血清中的含量极低（310-4 mg mL-1），与速发型的过敏反应密切相关。链、链和链还可以进一步分为不同的亚类，人链为1，2，链为1，2，链为1，2，3，4。因而IgG，IgA和IgM又分为8种亚类即IgG（1，2，3，4），IgA（1，2）和IgM（1，2）。,7. 1. 2 抗原抗体反应抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合可以是游离形式的，也可以是结合在细胞表面。它只局限于大分子的表面特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以分子间的亲和力，包括氢键、范

7、德华力、静电作用力和疏水作用等的作用方式结合在一起，是非共价的、可逆的。,抗原-抗体反应在体外也能发生，其特性符合许多化学反应的基本原理。抗体和与之结合的抗原在分子结构上的互补性，决定了反应的高度特异性。同时由于抗体分子结构的特点，以及抗原分子结构的多样性，抗原抗体的结合反应表现出复杂性。,抗原抗体的结合强度在一定条件下取决于抗原与抗体的亲和力，其反应可用下式表示：,Ag + Ab AgAb (7.1),k1,k2,AgAb 是抗原与抗体的复合物，根据质量作用定律,Ag、Ab和AgAb分别是抗原、抗体与抗原-抗体复合物的平衡浓度。平衡常数K为亲和常数，又称为结合常数，k1，k2分别为结合和离解反应速率常数，单位分别为mol-1Ls-1和s-1。K值越大，结合能力越强，亲和力越大。,亲和力的大小依赖于抗体的结合位点和抗原决定簇在空间上的密合程度以及相互作用力的性质，它与溶液温度、pH和离子强度等因素有关。当K在1071012mol-1L时，为高亲和力抗体，K107 mol-1L时，为低亲和力抗体。当抗原结构发生某些微小改变时，会引起抗原-抗体的亲和力的很大变化。,