DB11 T 960-2013 梅花鹿胚胎移植技术规程.pdf

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1、 ICS 65.020.30 B 44 备案号 :36785-2013 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 960 2013 梅花鹿胚胎移植技术规程 Code of practice on embryo transfer in the sika deer 2013 - 01 - 31发布 2013 - 05 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 9602013 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 供体鹿选择、超数排卵及配种 . 2 4 手术法冲胚 . 2 5 胚胎质量鉴定 . 3 6 受体鹿移植 . 3 7 记录 . 4 附录 A（资

2、料性附录） 梅花鹿胚胎移植记录表 5 DB11/T 9602013 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。 本标准由北京市农业局负责组织实施。 本标准起草单位：北京市畜牧兽医总站、中国农业大学。 本标准主要起草人：刘国 世、 蒋益民 、 薛水玲 、 王俊 、 史文清 、 朱士恩 、 云鹏 、 王梁 、 薛振华、 任 康 、 赵广华 、商 业、 张鲁 。 DB11/T 9602013 1 梅花鹿胚胎移植技术规程 1 范围 本标准规定 了供体鹿选择、超数排卵及配种、手术法冲胚、胚胎质量鉴定、受体鹿移

3、植 方法和记录。 本标准 适用于 梅花鹿的胚胎 生产 和移植。 2 术语和定义 下列术语和定义 适用于 本文件。 2.1 供体鹿 donor 在 胚胎移植 过程 中提供胚胎的母 鹿个 体。 2.2 受体鹿 recipient 在 胚胎移植 过程 中接 受胚胎的母 鹿个 体。 2.3 试情公鹿 teaster deer 用于母 鹿发情 鉴定 ,输精管结扎的 公鹿。 2.4 超数排卵 multiple ovulation 在母畜 发情周期 的适当时间，应用外源促 性腺激素处理，使 卵 巢比自然发情时有更多 的卵 泡发育并 排卵，也简称为“ 超排 ”。 2.5 阴道栓 vaginal supposi

4、tory 一 种 内含孕酮 、用特制 的放置器将其放入 阴道 的同 期发情 装置 。 2.6 胚胎移植 embryo transfer 将体内 、 外生产 的哺乳动物早期 胚胎 ， 移植 到另 一头同种的 生理 状态相同或相似的 雌性 动物 生 殖道 内，使 之继续 发育 成为 新个 体的技术。 DB11/T 9602013 2 3 供体鹿选择、超数排卵及配种 3.1 供体鹿选择 体况良好 、生 殖机能正常 ，系谱完整 、有 种用 价值且年龄 在3 5周 岁的 成年 母鹿。 3.2 超数排卵 放置阴道栓 （当 天记 为第0 天） 后第 9天开始注射 促卵 泡素 （FSH） ， 每天注射两次 间

5、 隔12h， 早晚各 1次 ， 4天 8次等 量或减 量注射 。 到第 1213 天结 束， 共注射 FSH 320mg。第 7次注射FSH 时取 出阴道栓 。 3.3 发情鉴定 阴道栓取 出后 24小时 开始 用试情公 鹿每隔 6h试 情一 次， 每次持续 0.5h 1h。 母 鹿稳定 接受 爬跨即为 发情。 3.4 配种 供体鹿 发情 后8h 12h 麻醉， 直肠把握 人工授 精配种。 间 隔 8h12h 重复 输精一 次 。 每次 输精 冻精 剂 量 为 2支 /头（ 每支冻 精的 有效精 子数 在1000万以上 ）。 4 手术法冲胚 4.1 冲胚器材、药品及试剂 4.1.1 器材 套管

6、针 、冲胚 管、 注射 器、 肠钳夹 、 培养皿 、手术 刀、手术 缝合针 和缝合 线、体 式显微镜 、 恒温板 等 。 4.1.2 药品及试剂 含0.3% 胎牛血 清的 磷酸缓 冲液 （ PBS）、胚胎 保存液 （ Holding液）、 青霉 素、 链霉素 、 石蜡油 、 麻 醉药、 解麻 药等 。 4.2 冲胚 4.2.1 术前准备 供体母 鹿第 一次 配种 后6d 7d手术法冲胚 ，母 鹿术前 禁食 24h。 4.2.2 麻醉与保定 术前进行全身 麻醉 。冲胚 时将母 鹿放于 保定 架， 呈前 低 后高仰卧保 定。 4.2.3 术部消毒 术 部 位于 腹部 中线距 乳房约 4cm处。 麻

7、醉后 的母 鹿术部备皮 ，用 温水清 洗， 5%碘酊和 75%酒精 消毒。 4.2.4 手术方法 4.2.4.1 冲胚在 冲胚 室内 进行 。 DB11/T 9602013 3 4.2.4.2 在腹部 中线距 乳房基部 前约 4cm 处做 一切 口，然 后 将 两 侧 子 宫角 和输 卵管 暴露 ， 观察左右 卵 巢上的 黄体 发育情 况并 记录。 4.2.4.3 在一侧 子宫角基部 用止血 钳穿孔 ， 插 入冲胚 管， 由充气 管 注入 5ml左右空气 ,使气囊封阻 子宫 腔；在 子宫角 和输 卵管结 合部的 子宫角端插 入套 管针 ， 拔出 针芯 ，将 装有 PBS的 50ml注射 器接

8、到套 管 针上，然 后注入 3537 的 PBS 30ml50ml ，将胚胎从 子宫角 的上 端冲出 ，由冲卵 管的出 液孔收集 于培养皿 （直径 90mm）中, 放 气后取 下冲胚 管。 4.2.4.4 用同样 方法冲 取另 一侧 子宫角的胚胎。 4.2.4.5 冲胚完成后 将子 宫角 放回 体内，并用 0.9%的生理 盐 水进行 冲洗 ,并 注入 2ml石蜡油以 防止 生 殖道粘连 。 4.2.5 缝合与消毒 左右子 宫角创 口各缝 1针 ,腹膜和 肌肉层连 续缝合， 皮肤结结 缝合 ，用5% 碘酊消毒。术 后 3天 内每天 注射2 次青霉 素、 链霉 素等抗 生素 。 5 胚胎质量鉴定

9、5.1 检胚 将 冲胚后 回收液 平皿放在 30 的 恒温板 上 ，在 2025 的 无菌操作 室内的体式显微镜 下进行 检 查 。 检 出的胚胎 用吸 卵器 移入PBS 中进行 鉴定 ，确 定受 精 与否 及胚胎 发育 阶段 。 5.2 胚胎质量分级 5.2.1 配种 后 6d7d 的胚胎 发育阶段应为 桑椹 胚或 囊胚。 5.2.2 胚胎质量 分为 A、 B、 C、D 四 个等 级 ,A、 B、 C级 胚胎 为 可用 胚胎 ，D 级为 不可 用 胚胎。 A级 ：胚胎 发育 阶段与 胚 龄一致 ， 胚胎 形态完整 ， 轮廓清 晰 ， 呈 球形 ， 分裂球 大 小均匀 ，结 构 紧凑， 色调

10、和透明度 适中 ，无游离 的细胞 和液 泡, 或 很少， 变性 细胞 比例少于 10%； B级：胚胎 发育 阶段与 胚龄基 本 一致。 轮廓 清 晰， 分裂球大 小基 本一 致， 色调 和透明度 及细胞 密度良好 ，可见 到一 些游离 的 细胞 和液 泡， 变性 细胞占 11% 30%； C级：胚胎 发育 和胚 龄不太 一 致， 轮廓不 清晰 ， 色调变暗 ，结 构较松散 ， 游离 的 细胞 或液 泡较 多，变 性细胞达 31%50%； D级： 有碎片 的卵、 细胞无 组织 结构 ，变 性细胞占 胚胎大 部分 ， 约 75%。 6 受体鹿移植 6.1 移植器械、药品及试剂 6.1.1 器械 手

11、术刀 、手术 缝合针 和缝合 线 、腹腔 内窥 镜、 宫颈 钳、移植 针等 。 6.1.2 药品及试剂 孕马血 清促 性腺激素 (PMSG) 、胚胎 保存液 （Holding 液 ）、 5%碘酊 、青霉 素和 链霉 素等 。 6.2 受体鹿选择 体况良好 、生 殖机能正常 ，年龄 在2 5周 岁的 母鹿。 DB11/T 9602013 4 6.3 同期发情 受体鹿 放置 阴道栓 进行 同期发情， 第12天 撤栓 （放 栓 当天记 为第 0天 ）。撤 栓 时 肌肉 注射 300IU的 PMSG。 6.4 术前准备、麻醉、保定和消毒 同4.2.1 、 4.2.2和4.2.3 的 处理方 法。 6.

12、5 胚胎移植 6.5.1 移植方法 可采用 腹腔 内窥 镜方 法。 6.5.2 受体鹿黄体的观察 在 乳 房前 方腹 中线 两侧 各切 开 一个 0.5cm1cm 长的 小口，一 侧插 入打 孔器 和腹腔镜 ， 另 一侧插入宫 颈 钳。 通过 腹腔镜 和宫 颈 钳相互 配合 观察 受体鹿的卵 巢 状态， 记录 黄体数 目 。 挑选单 侧卵 巢1 3个 黄体 的受体鹿 进行 胚胎移植。 6.5.3 移植与缝合 6.5.3.1 将卵巢 上 有 1 3个 黄体 侧 的子宫角 取出 ，在 子宫角 的上 1/3部 位穿 刺， 连接 上结合 有 1ml 注射器 的塑 料移植 针。 6.5.3.2 将含有

13、12 枚胚胎的 0.3ml0.5m 的 Holding液，通 过 1ml注射 器缓 慢注 入子 宫角 。 6.5.3.3 受体鹿 左右创 口各缝 1针，外 涂 5%碘酊 。 6.5.3.4 移植后 肌肉 注射 黄体 酮。 7 记录 胚胎移植 过程 中应 记录供体鹿超数排卵、 输精 、冲胚、受体鹿移植 情况 ,记录内 容可参考 附录 A。 DB11/T 9602013 5 A A 附 录 A （资料性附录） 梅花鹿胚胎移植记录 表 表A.1 供体鹿超数排卵记录 表 养殖场： 供体号： 品种： 出生时间（年龄）： 断奶时间： 胎次： 发情状况： 超排处理时间： 激素： 批号： 总剂量： 第一天剂量

14、： 第二天剂量： 第三天剂量： 第四天剂量： 第五天剂量： 第六天剂量： 第七天剂量： 第八天剂量： 阴道栓： 批号： 总剂量： 放栓时间： 撤栓时间： 促排药： 注射日期： 剂量： 发情时间： 发情表现： 输精时间： 公鹿号： 精液品质： 冲胚时间： 冲胚人： 检胚人： 胚胎数量： 表A.2 供体鹿冲胚记录 供体 号： 冲胚 时间 ： 卵巢 PBS回 收 率 卵 巢 回收 卵数 未受 精卵 数 退化 卵数 216 细 胞 胚胎发育及等级 黄体数 （CL） 卵 泡 数 （ F） 枚 数 等 级 桑椹胚 囊胚 左 A B C D 左 A B C D DB11/T 9602013 6 表 A.3 供体鹿冲胚 汇总表 表 A.4 受体鹿移植记录 序号 受体号 移植时间 黄 体数（ CL） 移植胚胎数 胚胎等 级 供体号 备注 左 右 左 右 供体号 经产/ 育成 冲胚时间 黄 体数 胚胎数 胚胎等级 可用胚胎数 备注 _