GB T 28984-2012 香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS 65.020.01 B 16 号中华人民王丑二和国国家标准GNrj 284-2012 香蕉苞片花口十病毒检疫鉴定方法Detecion and identification. of banana brad mosaC virus 2012-12-31发布2013-06-01实施五最适J黯iEh费v，阿飞. 尹牛午二乙_;j，案数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会发布 GB/T 28984-2012 目Ij=i 本标准按照GB/T1. 1 -3盼9给出的巍剧起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民

2、共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人:闻伟刚、郭立新、杨翠云、陈先锋、雷荣、张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽。I GB/T 28984-2012 香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了香蕉苞片花叶病毒血清学和分子生物学特征的检测方法。本标准适用于香蕉组培苗和植株等芭蕉属寄主植物材料中香蕉苞片花叶病毒的检测，也适用于蜻虫等传播媒介中该病毒的检测。2 香蕉苞片花叶病毒基本信息中文名:香蕉苞片花叶病毒学名:banana bract mosaic virus 缩写:BBrMV属马铃薯Y

3、病毒属(Potyvirus)，香蕉苞片花叶病毒其他信息参见附录Ao3 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(Doubleantibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay , DAS-ELISA)、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(Rcv巳rsetranscription polymerase chain rcaction , RT-PCR)、实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-time fluorescent RT-PCR)进行检测鉴定。4 仪器设备、用具和试剂4. 1 仪器设备常规PCR仪、实时荧光PCR仪、

4、超净工作台、电子天平(感量:0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-800C)、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪。4.2 用具可调式微量移液器(2L、10L、100L、200L、1000L、5000L)及相应的元RNase吸头、元RNase离心管、PCR管和研钵等。4.3 试剂主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。5 检测5. 1 样晶制备取O.5 g10 g畸形、变色等症状的叶片或其他植物组织，在研钵或小型食品加工机中充分研磨，GB/T 28984-2012 取五分之一量的均匀后样品，转入离心管中，按1: 10(质量:体积)加入样品提取缓冲液振荡混匀

5、。媒介昆虫按1: 0 (质量:体积)加入样品提取缓冲液研磨混匀。2000 g离心10min，上清液即为DAS-ELlSA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液。注:提取液在3h内使用，否则保存在4.C条件下。5.2 检测方法5.2. 1 双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELlSA)DAS-ELISA检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染BBrMV的植物组织作阳性6 结果判定 / 样品经DLsEimA与R/fPCR检测，以均呈阳性，一HMj定时I携带香蕉苞脱口队毒。样品经D-时八与笑日J荧光议TPCR检测，结果均呈阳性，口JFumsij/时片花叶/ / / / 病毒。川、

6、矿/ 7 样品保存与记录7. 1 样品保存三-._ 一一经检测确定携带香蕉苞片花叶阔的样品保存在-80.0耕/，并做好登记和标记工作。样品保存期限至少1年。7.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间、地点、方法和结果等。血清学测定需有酶联反应吸光值的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值。结果记录与资料保存期限至少1年。2 附录A(资料性附录)香蕉苞片花时病毒相关资料A.l 名称中文名:香蕉苞片花叶病毒学名:banana bract mosaic virus 缩写:BBrMV 分类地位:马铃薯Y病毒属CPot

7、yvir)A.2 寄主范围目前只发现芭蕉属CMusaspp.)植物为其自然奇主。A.3 为害症状GB/T 28984-2012 病毒侵染香蕉植株后，病叶上沿着叶柄产生深绿色或褐色的梭条斑。而病株花序苞片上则出现黑色斑点，这些症状常常十分明显，引起香蕉减产和品质下降。A.4 分布地区该病毒主要分布于菲律宾和印度等国，在我国尚未见发生。A.5 传播方式可由玉米缝管蜡CRhoalosihurnmaidis)和棉蜘CAhisgossy抖。以非持久方式传播，长距离扩散则随感病植株的无性繁殖材料传播。A.6 粒体形态病毒粒子线形，长660nm760 nm，直径12nmo A.7 基因组能被SDS降解，用硫

8、酸铠溶液提取时，多数粒子的相对分子质量为38KDa，少数为55KD的用蔚糖溶液提取时，除上述分子外，还有少数相对分子质量为66KDa和21KDa的分子存在。3 GB/T 28984-2012 附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELlSA)B. 1 试剂B.1. 1 10xPBST缓冲液(pH7.4)氯化铀(NaCl)/乞二磷酸二氢饵(KH2P04)/卢/ 2g 磷酸氢二铀(Na2HPQo/，巧二三二11.5 g飞七氧化饵(KCl)/少/ 2g 毛吐温(Twcen-20;1/ 5 mL 二7.4，并定容至. 1.2 样品抽捏捏冲液(pl7们 亚硫酸铀/Na2$P3)21古r

9、酣(/yffjTwecn-20 / 20 mL 溶于900mL的1XPBS了牛，I1HCl调节pH至7.4，并定容至1000 rri:r，_。. 1.3包蹦体结冲液(PH9.6、/ 碳酸铀州icdh 碳酸氢铀(忡H坠/:;: / t灭飞i提着i7J( p , 盐酸(HCl)调节pH至9.6，并定容至1B. 1.4酶标抗明白4) 1XPBST缓冲液号斗800 mL /仨/牛血清白蛋白(BSA)父、兰兰-2 g .二/三/PVP(MW24 00040 000) 用灭菌蒸馆水定容至1000 mLo -:丁B. 1.5 底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)二乙醇胶97 mL NaN3 0.2 g f

10、.-一/ J 溶解于600mL的灭菌蒸悟水中，用浓盐酸(HCl)调节pH至9.8，然后定容至1000 mLo B. 2 检测B.2.1 包被抗体用包被缓冲液将BBrMV抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，室温孵育2h或4oC包被过夜。4 j GB/T 28984-2012 B. 2. 2 加捍清空酶联板孔中溶液，用PBST缓冲液清洗68次，在吸水纸上拍干。每孔加入100L制备好的样品检测粗提液，每个样品设2个重复。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照。室温孵育2h或4 oc过夜，B. 2. 3 加酶标抗体用酶标抗体缓冲液将酶标抗体按说明稀释。清空酶联板孔中溶液，用PBST缓冲液清

11、洗68次，在吸水纸上拍干。每孔加入100L酶标抗体溶液，室温孵育2h。/ / 样品OD405/阴性对照OD405值2，判为阴性。5 GB/T 28984-2012 附录C(规范性附录)RT-PCR方法C.1 主要试剂C. 1. 1 RNA提取试剂Trizol、三氯甲:皖、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙醋(DEPC)处理的ddHzO。C. 1. 2 RT-PCR反应试剂一步RT-PCR反应试剂:amv反转录酶(5U/L)、RNA酶抑制剂(40Ujf1-L)、amv-OtimizedTaq聚合酶(5UjL)、10XRT缓冲液(含50mmol/L的Mg2+)、dNTP混合物(各10mmol/L)。C

12、. 1.3 电泳缓冲液TAE(50X) 三起甲基氨基甲:皖(Tris)冰乙酸242 g 52.1 mL 乙二胶囚乙酸二铀(Na2EDTA.2HzO)37.2 g 用灭菌蒸馆水定容至1000 mL。用时加灭菌蒸锢水稀释至1XTAEoc. 1.4 漠化Z链(EB)溶液(10g/JLL)澳化乙链灭菌去离子水C.2 RNA提取20 mg 20 mL C. 2.1 取100L样品检测粗提液到1.5 mL离心管中，再加入700LTrizol和200L三氯币烧，上下颠倒混匀5min;4 oC 10 000 g离心10min，小心吸取上层元色水相到新离心管中。C.2.2 加入等体积异丙醇，混匀，40C静置10

13、min;40C 10000 g离心10min，弃上清液。C.2.3 加入700L70%乙醇清洗一遍沉淀。RNA沉淀干燥后，加入20L焦碳酸二乙醋(DEPC)处理的ddHzO溶解。注:在保证能够得到质量满意的总RNA情况下，也可以采用其他总RNA提取方法。C.3 引物序列BBrMV1:5人gctgaggcatacataacaatgcg-3; BBr MV2 : 5 -cccaagcagagagtgca ta tcac-3。预期扩增片断长度为287忡。C.4 RT-PCR扩增反应体系如下:10XRT缓冲液(含50mmol/L的Mg2+)2.5L、dNTP混合物(各10mmol/L) 6 、/ GB

14、/T 28984-2012 2. 5L、RNA酶抑制剂(40U/.lL)O. 5 /.lL、amv反转录酶(5U/.lL) 0.5 /.lL、amv-OptimizedTaq聚合酶(5U/L) 0.5L、BBrMVl引物(20mol/L)O. 5L、BBrMV2引物(20mol/L) O. 5L、总RNA 1L、RNascfree dHz 0 16. 5L，总体积25L。使用Onc-stcpRNA PCR kit试剂盒或其他等效产品，也可采用两步法RT-PCR反应试剂，操作步骤按使用说明进行。每个样品设2个重复，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。反应条件:50飞DNA合成30min , 9

15、4 oc预变性2min;940C变性30s , 60 oC复性30s , 72 oC延伸1 min，35个循环;最后72oC延伸5min C.5 琼脂糖凝股电泳检测H条荒j经测序和同源、性比较，结7 GB/T 28984-2012 附录D(规范性附录)实时荧光RT-PCR方法D.1 实验步骤D. 1. 1 引物和探针序列引物序列:BBr MV -TF : 5 -caaaaactacgaacagggctagaga 3 BBrMV-TR: 5 - ccgagtgtttgatccacgaa-3 探针序列:BBr MV -pro bc: 5 -F AM-cacacacgcagatgaaagctgcag

16、c-Ecli pse-3 D. 1.2 RNA提取操作方法见附录C.20D. 1. 3 实时荧光PCR反应体系反应体系如下:2 X Onc Step RT-PCR Buffer皿10L、20mol/L上下游引物各O.6L、20mol/L荧光探针O.6L、50X ROX reference dyc O. 4L、5U/LEX TaqTM HS O. 1L、PrimcScript RT Enzyme MixII 0.1L、总RNA1p.L、RNasefree dH 20 6L，总体积20L。采用Onc St巳pPrimcScript RT-PCR Kit (Perfcct Real Time)或其他

17、等效产品，也可采用两步法实时荧光RT-PCR反应试剂，操作步骤按使用说明进行。每个样品设2个重复，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。D. 1. 4 实时荧光PCR反应参数反应条件:42oC 5 min , 95 oC 10 s;然后95oC 5 s , 60 oC 31 s，共10个循环。本反应条件适用于ABI 7000型荧光PCR仪，如使用其他荧光PCR仪，可以根据仪器性能进行适当调整。仪器操作方法按照设备使用说明进行，反应结束后保存各项数据和图像。D.2 结果判定D. 2.1 阐值设定阔值设定根据仪器噪音情况进行调整，或以阔值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。D.2.2 质控标准阳性

18、对照的Ct值应30.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验结果元效。阴性对照和空白对照元Ct值。、d y GB/T 28984-2012 D. 2.3 结果判定样品元Ct值并且无扩增曲线，判定为阴性。样品Ct值35.0，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性。样品Ct值在35.010. 0之间时，应重新提取样品总RNA进行扩增检测。重做结果元Ct值，判为阴性;否则判为阳d性。9 NFQN!寸NH阁。, d 人民共和国家标准香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法GB/T 28984-2012 国华中法中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)、网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销导开本880X12301/16 印张1字数18千字2013年3月第一版2013年3月第一次印刷18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价争e书号:155066. 1-46389 GB/T 28984-2012 打印日期:2013年4月10日F002A