GB T 19495.3-2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法.pdf

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1、ICS 77“自40.30H 15 B 中华人民共和国国家标准GB/T 11067.2-2006 代替GB/T11067. 21989，部分代替GB/T11067. 7一1989银化学分析方法铜量的测定火焰原子版收光谱法Methods for chemical analysis of silver -Determination of copper contents -Flame atomic absorption spectrometric method 2006心9-26发布中华人民共和国国家质量监督检验检在总局中虽国家际准化管理委员会2007-02翩。1实施发布GB/T 11067.2-2

2、006 前言GB/T 11067银化学分析方法分为如下几个部分：GB/T 11067. 1 银化学分析方法银量的测定氯化银沉淀火焰原子吸收光谱法GB/T 11067. 2银化学分析方法铜量的测定火焰原子吸收光谱法GB/T 11067. 3银化学分析方法晒和暗量的测定电感糯合等离子体原子发射光谱法GB/T 11067. 4银化学分析方法锦量的测定电感糯合等离子体原子发射光谱法GB/T 11067. 5银化学分析方法铅和销量的测定火焰原子吸收光谱法GB/T 11067. 6银化学分析方法铁量的测定火焰原子吸收光谱法本标准代替GB/T11067. 1 11067. 71989银化学分析方法儿本部分为

3、第2部分。本部分代替GB/T11067. 2 1989银化学分析方法火焰原子吸收光谱法测定铜和金量和GB/T 11067. 7 1989银化学分析方法发射光谱法测定铜、销、铁、铅、金和销量中铜量的测定。本部分与GB/T11067. 2 1989以及GB/T11067. 71989中铜量的测定相比，主要有如下变动：取消了采用发射光谱法测定铜量的方法，采用火焰原子吸收光谱法测定铜量。对火焰原子吸收光谱法测定方法进行文字性修改，补充了质量保证和控制条款；增加了重复性条款。本部分由中国有色金属工业协会提出。本部分由全国有色金属标准化技术委员会归口。本部分由大冶有色金属公司负责起草。本部分由江西铜业公司

4、贵溪冶炼厂起草。本部分由大冶有色金属公司、内蒙古乾坤金银精炼股份有限公司参加起草。本部分主要起草人z夏珍珠、梁亚群、邱继英、杨红生、占光仙。本部分主要验证人z李玉琴、潘晓玲、马蓉、郭树有。本部分由全国有色金属标准化技术委员会负责解释。本部分所替代标准的历次发布情况为2一GB/Tll0672 1989, GB/T 11067. 7 1989, 1 范愚银化学分析方法制量的耐定火焰原子眼收光谱法本部分规定了银中铜含量的测定方法。本部分i毒用于银中锅含量的测定搜j蠢范!llJ,O. 000 5% 0. 060%。2 方法原理GB/T 110号7.2-2006试料黑硝酸溶解，溶液郊主支援使生成氯化银沉

5、淀，过滤分离后，加盐酸蒸至近子，转化成盐酸介质待测溶液。使用空气一乙快火焰，于原子吸收光谱仪波长324.8 nm处测量铜的吸光度。3试Jill3. 1 硝酸（pl.42 g/mL) 3. 2 硝酸。十1)。3.3盐酸Cpl.19 g/mL)。3. 4盐戳(I十IL3.5 盐酸（2十98）。3.6铜标准贮存溶液s称取1.000 0 g金属锵（99.99%），置于100mL烧杯中，加入20mL硝酸(3.幻，盖上表鼠，加热至完全溶解，煮沸驱除氮的氧化物，取芋，用水洗表现及杯垒，冷至室源，移入1 000 mL容繁瓶中，用水稀释刻度，混匀。此溶液1mL含1mg钢。3. 7 锅标准溶液z移浓25.00 m

6、L锅标准贮存溶液（3.们参案子1000 mL容最瓶中，如人20mL苦曹雪童(3. 2），用水稀释至刻度，混匀。此溶液1mL含25g铜。4 仪器原子吸收光谱仪，附铜空心阴极灯。在仪器最佳工作条件下，凡室主达到下列指标辛苦均可使用。一一特低浓度：在与测量试液基本相一致的溶液中，钢的特征浓度不大于O.023 g/mLo 一一精密度s最高浓度的标准溶液酒j最10次吸光度，其标准偏爱应不超过平均吸光度的1.0% ;)tl 最低浓度的标准溶液（不是“零”浓度标准溶液）测缝10次吸光度，其标准偏差应不超过最高浓度标准溶液的平均吸光度的0.5%。一一工作也线线饺2将工作必线按浓度分成5段最高段的吸光度差值与最

7、低段的吸光度差值之比，不小于0.8。5 分按步骤5. 1 试料按表1称取试样，精确到0.001富。GB/T 11067.2-2006 表1铜的质量分数%试料g硝酸（3.2l/mL 盐酸（3.4)/mL 容量瓶体积mL0 oco 5 o. 002 0 5. 000 20 10 50 O 002 0 0 008 0 3. 000 20 5 100 O. 008 0 0 020 l oc 10 3 100 O. 020 0 060 1 000 10 3 250 5. 2 空白试验随同试料做空白试验。5. 3 ill 5. 3. 1 将试料（5.1)置于250mL烧杯中，按表l加硝酸（3.2），盖上表

8、皿加热溶解，取下，用水洗表皿及杯壁，加热煮沸。5. 3. 2调整溶液体积约70mL，置于电热板上加热，在不断搅拌下，按表l加入盐酸（3. 4），煮沸至透明，静置30mino 5. 3. 3 用慢速定量滤纸过滤，用热盐酸（3.5）洗涤杯壁及沉淀6次7次，滤液连同洗液加入盐酸5mL (3. 4），加热蒸至近干，取下。再加入5mL盐酸（3.4）加热至微沸，取下冷却。5.3.4 按表l用水移入相应的容量瓶中，每100mL体积补加5mL盐酸（3.4），混匀。5.3.5 使用空气乙烘火焰，于原子吸收光谱仪波长324.8 nm处，以水调零，与系列标准溶液平行测量试液的吸光度，减去随同试料空白溶液的吸光度，从

9、工作曲线上查出相应的铜浓度。5.4 工作曲线的绘制5. 4. 1 移取0mL,1. 00 mL,2. 00 mL,4. 00 mL.6. 00 mL.8. 00 mL.10. 00 mL铜标准溶液（3.7），分别置于一组100mL容量瓶中，各加入5mL盐酸（3.4），以水稀释至刻度，混匀。5. 4. 2 在与测量试液（5.3. 5）相同的条件下，以水调零，测量系列标准溶液的吸光度，减去系列标准溶液中“零”浓度溶液的吸光度。以铜的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制工作曲线。6 分析结果的计算接下式计算钢的质量分数w(Cu),T U唱八 w(Cu)(%J 乙一一一一100m 式中2c 自工作曲线上查

10、得铜的浓度，单位为微克每毫升（g/mL);V一一试液的总体积，单位为毫升（mL);m一一试料的质量，单位为克（g）。7 精密度又1重复性在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值，在以下给出的平均值范围内，这两个测试结果的绝对差值不超过重复性限（r），超过重复性限价）的情况不超过5%，重复性限（）按表2数据采用线性内插法求得。铜量%）r/(%) 0. 001 l 0. CJO 2 表20. 005 0 0. 009 2 。0522 0. 000 5 0. 000 7 0. 002 0 GB/T 11067.2-2006 7. 2 再现性在再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于再现

11、性限（酌，超过再现性限（R）的情况不超过5%，再现性限（R）按表3数据采用线性内插法求得。注重复性（r）为2.85, .s.为重复性标准差。再现性情）为2.ss . s.为再现性标准差。铜量（%）RIC%) 8 质量保证和控制0. 001 1 0. 000 3 表30. 005 0 0. 009 2 0. 000 8 0. 001 9 0. 052 2 0. 004 0 应用国家级标准样品或行业标准样品（当两者都没有时，也可用控制标样替代），每周或每两周校核一次本分析方法标准的有效性。当过程失控时，应找出原因，纠正错误后，重新进行校核。GB/T 19495. 3-2004 DNA宜重悬在水或缓

12、冲液中以防止DNA降解。5. 2. 2 提取空白对照为了检查在提取过程中可能存在的污染应设置提取对照（提取空白对照），提取空臼对照宜用缓冲液或者水代替样品。理想情况下提取空白对照也可以作为试剂对照。提取空白对照的试管应置于每个提取系列中的最后一个。加人异源核酸或者核酸担体（如：糖原、PEG）作为共沉淀剂，可能在改善提取过程中的污染有帮助。共沉淀剂可以是不相关的DNA（如：蛙鱼或青鱼精子DNA），也可以是非转基因原材料或粗加王品DNA，非转基因产品测试样品同时提取时还可作为转基因产品检测的阴性对照。当使用核酸担体时，应注意加入到jPCR反应体系中的总DNA模板量，超量将抑制PCR反应。5.2.3

13、 提取回收率对照在建立种新的DNA提取方法时，或者在使用附录中的方法提取种未曾使用该方法提取过的样品DNA时电应对该方法的提取效率进行评估z加入一定已知含量的示踪DNA(tracer DNA）到测试样品中，并且设立一个不加示踪DNA的对照测试样品，对这两个样品同时提取DNAO根据示踪DNA的提取得率，判断该方法提取该样品的DNA得率。设立提取回收率对照可用于判断测试样品中是否含有可提取的DNA或是否含有PCR抑制剂。5. 2. 4 DNA提取液PCR抑制物的判断在建立种新的DNA提取方法时，应对所提取的DNA溶液中是否含有PCR抑制剂进行判断。加入接近PCR检测下限含量或超过检测下限数倍含量的

14、目标核酸到DNA提取液中，然后进行PCR测试。如果DNA提取液和加入了目标核酸的DNA提取液均未出现扩增，而单独检测目标核酸时能出现扩增，则说明DNA提取液中存在PCR抑制物。5. 3 DNA定量5. 3. 1 一般性要求DJA JE量可以：比较不同提取方法对同一样品的DNA提取效率，在PCR反应前校准DNA的量；监测同一样品不同批次的DNA浓度的变化。5. 3. 2 DNA定量方法5. 3. 2. 1 紫外光谱法5. 3. 2. 1. 1 范围紫外光谱法为溶液中DNA浓度定量的常规方法。5. 3. 2.。1.2 原理溶液中的核酸可以吸收210nm 500 nm的紫外线(UV），并且在260n

15、m达到吸收高峰。因为DNA、RNA在260nm都有它们的吸收高峰，因此，核酸溶液中RNA和单核昔酸污染物无法用UV光谱进行辨别。5. 3. 2. 1. 3 应用范围本方法可以用来定量从2g/mL50g/mL的DNA含量。在定量之前，为了与光谱仪（光密度从。叼05）的曲线保持一致，应该对需要定量的DNA溶液进行适当的稀释。注偶然情况下残留的成分（比如来自于CTA!l法ONA的提取过程）可能会干扰UV在260nm的探测，因为CTAB在这个波长也被吸收。5.3.2.2 琼脂糖电泳法5. 3. 2. 2. 1 范围琼脂糖电泳法为是溶液中DNA浓度定量的常规方法。琼脂糖电泳法叮分析物理影响因素，如DNA

16、降解程度、RNA残留的存在和一些污染物。GB/T 19495. 3-2004 琼脂糖电泳法适用于在DNA的浓度不足以进行光谱定量、或DNA的纯度不高、或混有某些可吸收紫外线的杂质的DNA溶液浓度的测定。DNA降解的情况下，不推荐使用凝胶电泳的方法进行DNA定量。5. 3. 2. 2. 2 原理当DNA处于分子筛中（比如琼脂糖），在缓冲液存在的情况下，处于电场中，根据DNA本身所携带的电荷和分子量，可以被电泳分离。澳化乙键可以镶嵌到DNA分子中，当受到紫外线激发时，散发出楠黄色的荧光。由于澳化乙镀也可镶嵌到单链DNA和RNA分子中，对于更精确DNA定量，需要用酶去除RNA.由于荧光的亮度与总DN

17、A量成正比，因此，根据荧光强度，与己知含量的不同浓度的标准DNA进行对比可获得样品DNA溶液的浓度。标准DNA的分子量应该和待测DNA的分子量相近，因为澳化乙键的镶嵌，荧光的散发和DNA片段的长度相关。5. 3. 2. 2. 3 应用范围在使用光学成像系统的条件下，本方法可以对浓度从5ng 500 ngDNA进行定量。5.3.2.3 实时荧光PCR法来对提取的DNA进行定量的方法当提取DNA含量少的样品时，由于方法灵敏度的因素，上述方法都不可以进行DNA定量，只能采用实时荧光PCR法。具体内容见本系列标准GB/T19495. 5 2004 0 5. 4 提取DNA的稳定性提取的DNA应保存好，

18、以保证其在后续分析中的稳定性，避免反复冻融。6 测试报告每次提取DNA实验的测试报告应包含GB/T19495. 1 2004中规定的内容，还应包括z样品来源；一一客户要求；采样日期及采样方式（若知道）；收样日期；DNA提取前对实验室样品的初步处理；用于提取DNA的测试样品的大小；-DNA提取应用的程序；一测试中的任何异常点；方法中未提到或可选择但可能对结果有影响的操作；原始实验纪录，实验室日志；分光光度计或其他DNA定量方法的纪录；一一具体的PCR方法和DNA提取对照；一一胶片的负片；一一结果的解释；实验者姓名。A.1 酣三氯甲炕1法A. 1. 1 范围附录A（规范性附录）酣三氯甲烧法提取DN

19、A本方法适用于从多类样品中提取DNA.适用范围广。GB/T 19495. 3-2004 当分析富含多元醇，叶片或者绿色物质时（比如菊宣叶片，干燥的茵稽等），很多PCR抑制剂会和DNA共沉淀。由此可能在获得PCR扩增产物时会遇到困难。考虑到盼可能产生的腐蚀作用，应建立CTAB和（或lPVP和（或）硅藻土吸附等方法。A. 1. 2 原理本方法由裂解（在高浓度EDTA和sos的情况下进行热裂解）、盼三氯甲炕去除杂质（如脂类分子，多糖和蛋白质）以及包含DNA水相中的核酸酶、最终用乙醇沉淀DNA并除去盐及残留的三氯甲烧几个步骤组成。本方法的关键步骤是裂解。A. 1. 3试剂A. 1. 3. 1 96%乙

20、醇（C,H二om,20保存及应用。A. 1. 3. 2 冰乙酸CCH,COOH）。A. 1. 3. 3 乙酸锦（KC2H,02),A. 1. 3. 4 37 %盐酸（HC）。A. 1. 3. 5 异戊醇CCH,)2CHCH2CH20H, A. 1. 3.6盼CC,H,0）。A. 1. 3. 7 三氯甲炕CCHCl,J。A. 1. 3. 8 Tris( hydroxymethy) aminomethane, TRIS( C4 H11 N03）。A. 1. 3. 9 乙二胶四乙酸二饵盐K2EDTA(C10HN20,Na2）。A. 1. 3. 10 氢氧化饵CKOH）。A. 1.3. 11 氯化何C

21、KCI)。A. 1. 3. 12 二烧基磺酸纳SOSCC, HO,SN）。A. 1. 3. 13 蛋白酶K，冷冻干燥条件下约20IU/mg , A.1.3.14 RNA酶，无DNA酶，来自牛膜腺，冷冻干燥条件下50IU/mg , A. 1. 3. 15 饱和盼。A. 1. 3. 16 三氯甲烧s异戊醇，24: , A. 1. 3. 17 盼：三氯甲烧2异戊醇，25: 24 : 1, A. 1. 3. 18 抽提裂解缓冲液（pHS. 0), TRIS 0. 050 mol/L，几EDTA0. 050 mol/L,SDS 30 g/L，使用HCl或KOH调节pH,A. 1. 3. 19 TE缓冲液

22、（pHS.0), TRIS 0. 010 mol汀，几EDTA0. 001 mol/L，使用HCl或KOH调节pH,A. 1. 3. 20 蛋白酶K溶液，蛋白酶K20 mg/mL，无菌水溶解，不要灭菌，一20保存，避免反复冻融。A. 1. 3. 21 RNAse A溶液，10mg/mL, 20保存，避免反复冻融。A. 1. 3. 22 70%乙醇溶液CC,H50H),20保存。GB/T 19495. 3-2004 A. 1. 3. 23 乙酸饵溶液.3mol/L，使用乙醋酸调节pH值到5.2，不要灭菌（0.22 m膜过滤）。A. 1. 4 主要仪器设备A. 1.4. 1 离心机。A. 1. 4

23、. 2 水浴锅（60飞70工作范围）。A. 1. 4. 3 真空干燥机。A. 1. 4. 4 冷冻干燥机。A.1.4.5 涡旋机。A. 1.5 提取步骤a) 称取o.25 g粉碎、磨碎或液体材料至离心管中。b) 加入1.6 mL抽提缓冲液，50L蛋白酶K溶液，60至70。温育30min至2h（可过夜）。c) 加人RNA酶至终浓度0.1 g/ mL。5000 g离心30min，吸取上清液至另一离心管中。d) 加入等体积的饱和盼，i昆匀，5000 E离心15min，吸取上层水相至另新离心管中。e) 加入等体积酣2三氯甲炕z异戊醇至上清液中，混匀，5000 g离心15min吸取上层水相至另一新离心管

24、中，重复该步骤1次2次，直至中间相清亮。f) 加入等体积三氯甲烧z异戊醇至上清液中，5000 g离心10min吸取上层水相至另一新离心管中，重复该步骤1次2次，直至中间相清亮。g) 加入0.I体积的乙酸御溶液及2.5体积的96%乙醇，轻轻颠倒混匀，液氮中放置5mm, 或80放置lh，或20过夜。h) 10 000 g （或13000 g) 4离心至少15min，弃上清液，用2体积的70%乙醇小心洗涤沉淀，10000 g （或13000 g) 4离心15min,1J、心倒掉上清。干燥沉淀。1) 用100L水或TE缓冲液溶解沉淀，得到DNA储存液。注根据样品量调整缓冲液的体积。A.2 商量三氯甲烧

25、2；丢A.2. 1 范围本方法适用于从香肠中提取总DNA，包括细菌基因组DNA。从发醉香肠及热发酵香肠中提取的DNA，可用于PCR法检测重组DNA。本方法适用于从乳酸样品中分离总DNA以特异地检测金黄色葡苦苦球菌（Sta卢hylococcusa are us）。本方法在采样量。.4 g的情况下在实验室之间证明有效。A.2.2 原理本方法包括从匀浆的香肠样品中回收细菌细胞，随后经过离心，沉淀物不仅包含细菌而且包含肉颗粒。济菌酶降解细胞壁可特异裂解细菌，肉乳杆菌细胞壁的裂解，可加入变溶菌素。sos及蛋白酶knJ完全的裂解细胞，随后用盼三氯甲烧异戊醇几次抽提水相。盼三氯甲烧有利于去除核酸酶及PCR反

26、应抑制剂。最后用乙醇沉淀DNAOA. 2. 3 安全防护在处理有机试剂时采用通风橱。A. 2. 4 试剂A. 2. 4. 1 异内醇CH3CHCOH)CH,oA. 2. 4. 2 96%乙醇（巳H,OHJ,20保存及使用。A. 2. 4. 3 冰乙酸CCH.,COOH)口A. 2. 4. 4 37%盐酸(HC）。A. 2. 4. 5 氢氧化饷ClaOHl。A. 2. 4. 6 异戊醇（CH,)2CHCH2CH20H。A. 2. 4. 7盼（C，日，0)。A. 2. 4. 8 三氯甲烧（CHCl，）。A. 2. 4. 9 Tris(hydroxymethy) aminomethane, TRIS

27、CC, H11 NO，）。A. 2. 4. 10 乙二胶四乙酸二纳盐（Na2EDTAJ。A. 2. 4. 11 十二烧基磺酸纳SOS(C12H200,SNa）。A. 2. 4. 12 溶菌酶，50000 JU/mg蛋白质。A. 2. 4. 13 煎糖（C12H22011）。A. 2. 4. 14 蛋白酶K，冷冻干燥条件下20JU/mg A. 2. 4. 15 乙酸纳（NaC2H202。A. 2. 4. 16 饱和盼。A. 2. 4. 17 三氯甲炕异戊醇，24: 1。A. 2. 4. 18 盼三氯甲烧异戊醇，25: 24 : 1 0 GB/T 19495. 3-2004 A. 2. 4. 19

28、 变溶菌素溶液，500JU/ml，或5000 IU/mL变洛菌素，无菌水溶解，不要灭菌，20保存，避免反复冻融。A. 2. 4. 20 熔菌酶榕液，10mg/mL，使用无菌水溶解，不要灭菌，20保存，避免反复冻融。A. 2. 4. 21 煎糖溶液CC,H,O,) ,400 g/L, A. 2. 4. 22 缓冲液A(pH8. 0), TRIS 0. 020 mol/L,Na2EDTA 0. 020 mol/L,NaCl 0. 1 mol/L，用HCl或NaOH调pH至8.0。A. 2. 4. 23 抽提裂解缓冲液，1体积缓冲液A和1体积的煎糖溶液。A. 2. 4. 24 SOS溶液，250g/

29、l，。A. 2. 4. 25 蛋白酶K溶液，20mg/mL，使用无菌水溶解，不要灭菌，保存在一20，避免反复冻融。A. 2. 4. 26 70%乙醇洛液（C,H50H),20保存及使用。A.2.4.27 乙酸锅溶液（NaC2H302),3mol/L，用乙醋酸调pH至5.2 A. 2. 4. 28 TE缓冲液，Tris0. 010 mol/L.Na,EDTA 0. 001 rnol/L，用HCl或NaOH调pH至8.00 A. 2. 5 主要仪器及设备A.2. 5. 1 粉碎机。A. 2. 5. 2 离心机（12 000 g) 0 A.2.5.3 水浴锅或温育器。A. 2. 5. 4 真空干燥器

30、（可选JoA.2.5.5 涡旋机。A. 2. 6 提取步骤a) 切下200mg 500 mg肉肠，加入到3体积的水中（至1.5 rnLl，室温放置10rnrn。切小心转移500L上清液至反应管中，12000 g离心10min，倒掉上清液。c) 加入500L抽提缓冲液悬浮沉淀，并加入500L溶菌酶溶液。若仅加溶菌酶效果不好，可加入10JU变溶菌素（须做预实验），37温育lh。d) 加入25LSDS溶液及25I，蛋白酶K溶液，60温育10mm, e) 加入等体积盼三氯甲烧异戊醇，i昆匀2min,12000 E离心3min，转移水相至另一新管中。f) 加入等体积三氯甲烧异戊醇，i昆匀2min, 12

31、 000 g离心3min，转移水相至另一新管中。g) 加人。.lX体积的乙酸纳溶液及1体积的异丙醇。颠倒几次混匀，室温放置至少30min, 12 000 g离心15min，弃上清液。h) 用2体积的70%乙醇小心洗涤沉淀，12000 g离心l0 min，小心倒掉上清。倒掉t清液，干燥沉淀。1) 用100川，水或者TE缓冲液溶解沉淀，得到DNA储存液。ft根据样品量调整缓冲液的体积cGB/T 19495. 3-2004 血，3酣三氯甲烧3法A. 3. 1 范围本方法适用于酸奶DNA的提取，适用于原昧酸奶及含各种水果、食品添加剂、稳定剂及不同含量脂肪的酸奶。也适用于热处理过的酸奶。A. 3. 2

32、原理本方法适用于特殊种类的食物样品。在碱性条件下溶解凝固的赂蛋白（coagulatedcasein）后收集革兰氏阳性菌的培养物。细胞悬浮在水相中，用溶菌酶（或变溶菌素）降解细胞壁。细胞裂解依靠去污剂SDS，蛋白酶K去除蛋白质，随后用盼三氯甲烧异戊醇抽提，最后用乙醇沉淀DNA,A. 3. 3 安全防护在处理有机试剂时采用通风橱。A. 3. 4试1fljA.3.4. 1 异丙醇CH,CH(OH)CH,A. 3. 4. 2 96%乙醇（C,H,OH),-20的条件下使用保存。A. 3. 4. 3 乙醋酸（CH,COOHl。A. 3. 4. 4 氯化饷CNaCll。A. 3. 4. 5 拧橡酸纳CC6

33、H,Na,07）。A.3.4.6 37%盐酸CHCll。A. 3. 4. 7 氢氧化纳CNaOHl。A.3.4.8 异戊醇CCH,)2CHCH2CH20H,A. 3. 4. 9盼（C6H60)。A. 3. 4. 10 三氯甲烧（CHCl,J。A. 3. 4. 11 Tris(hydroxymethyll-aminomethane TRIS, CC, H, NO,) , A.3.4. 12 乙二胶四乙酸二锅盐（Na,EDTAJ。A. 3. 4. 13 十二烧基磺酸铀SDSCC12H220,SNal,A. 3. 4. 14 溶菌酶，50ooo IU/mg蛋白质。A. 3. 4. 15 煎糖CC,H

34、,Oul。A. 3. 4. 16 蛋白酶K,20IV/mg，冷冻干燥状态。A. 3. 4. 17 乙酸销CNaC,H,O，）。A. 3. 4. 18 拧稼酸纳溶液（C,H,Na,0,),400g/l，。A. 3. 4. 19 氢氧化纳溶液CNaOH),O. 4 mol/L，无菌水溶解，不用灭菌，使用前准备。A.3.4.20 氯化纳拧橡酸纳溶液，5SSC.NaCl0. 75 mol/L.C, H5Na30, o. 075 mol/L，宜使用浓缩SSC溶液（20SSC），使用前稀释。A. 3. 4. 21 饱和盼。A. 3. 4. 22 三氯甲；皖z异戊醇，24 10 A. 3. 4. 23 盼z

35、三氯甲：皖2异戊醇，25 24 1。A. 3. 4. 24 变溶菌素溶液，500IU/mL或5000 IU/mL变溶菌素，无菌水溶解。不用灭菌，20保存，避免反复冻融。A. 3. 4. 25 熔菌酶溶液，10mg/mL溶菌酶，无菌水溶解。不用灭菌，20保存，避免反复冻融。A. 3. 4. 26 蕉糖溶液CC12H22011) ,400日I，。A. 3. 4. 27缓冲液A(pHS.0), TRIS 0. 020 mol/L. Na2EDTA 0. 020 mol/L. NaCl 0. 100 mol/L，用HCl或NaOH调节pH值。A. 3. 4. 28 提取裂解液，l体积的缓冲液A和1体积

36、的葳糖溶液。GB/T 19495. 3-20创A. 3. 4. 29 SDS溶液，250g/LoA.3.4.3号蛋白酶K溶液，20mg白L浓度，羌藏水溶解，不愿灭簿，2号保存，避免反复冻盖章。A. 3. 4. 31 70%乙醇溶液（C2H50HJ，20C使用和保存。A. 3. 4. 32 乙酸纳溶液（NaC,H,0,).3mol/L,ffl乙酸调节pH健到5.20 A. 3.4.33 TE缓冲液（pH8. 0), TRIS白.010 mol/L.Na2EDTA古.001 rnol/L，用HCl或NaOH调节pH值。A.3.5 主要仪器和设备A. 3. 5. 1 离心机(12000 g）。A.

37、3. 5. 2 水浴锅或加热装置。A.3. 5. 3 王军空子燥扰。A.3.5.4 1芮旋机。A.3.6 提取步骤a) 充分摇匀酸奶，取25百L酸奶到2mL的反应小管中。加入80L拧稼酸锵溶液。加入氢氧化纳溶液并且混匀。12000g离心2min, b) 丢弃上层的路肪郭水榕重新以500严LSSC溶泼悬浮沉淀。1200号z离心交少2距in，丢弃上清液。重新用500L 5SSC溶液溶解沉淀。12000 g离心至少2min，丢弃上清液。c) 用500L提取缓冲液悬浮沉淀。加入50L溶菌酶溶液。若仅加溶菌酶效果不好，可加10 TU变溶猿素须做预实验。dl 37C温育lh，加入25LSDS溶液和25L蛋

38、白酶K溶液，60温育10min，加入500L 自昏”三氯甲烧异戊醇溶液，j震匀2min, 12000 g离心3min，将上楼液转移到一个新的反应小管，加入1体积三氯甲烧手”戊醇溶液，混合2mi口，12000 g离心3min, e) 上f.R水相转移到新的反应小管中。加入0.1体积的乙酸纳溶液和I体积的异丙膊，室温下放辈辈30min, 12 000 g离心15缸in，奔上清液。用至少500L乙董事溶液小心洗涤沉淀12 000 g离心10min，丢弃上消液，干燥沉淀。用100L的水或者TE缓冲液溶解，得到jDNA储存液。注z根据样品量调整缓冲液的体积。A.4盼三氯甲镜4法A.4. 1 范翻本方法适

39、用于一步法从酵母，丝状JJ;菌或分离的菌落中提取PCR级的DNA。本方法适用于成分复杂的样品中部转基因激生物中DNA提取，尤其运房子对裂怨不敏感的真蔼或革兰氏在哥诠萄。A.4副2安余防护在处理有机试？同时采用通风橱。A.4.3试JillA. 4. 3. 1 96%乙薛（C,H,OH），在一20使用和保存。A.4.3.2 冰乙酸（CH,COOHl,A. 4. 3. 3 硫酸（H,SO,J,90%。A. 4. 3. 4 础是酸氢铮（KHCO，）。A.4 3.5 乙盖章铸CKC,H,02）。A. 4. 3. 6 37%盐酸(HC) A.4.3.7 3手戊醇CH,l,CHC民主CH20H,A.4. 3

40、.8盼（C,H,0）。A. 4. 3. 9 2王氯甲：皖（CHCl3）。GB/T 19495. 3-2004 A. 4. 3. 10 Tris(hydroxymethy) aminomethane TRISCC, Hu NO，）。A. 4. 3. 11 乙二胶四乙酸二饵盐K1EDTACCrnHH N10sNa2）。A. 4. 3. 12 氢氧化御CKOHl。A. 4. 3. 13 十二烧基磺酸纳SDS(C12 H25 04 SN a）。A. 4. 3. 14 RNA酶，不含DNA酶，来自于小牛膜腺，大约50JU/mg冷冻干燥状态下。A. 4. 3. 15饱和盼。A. 4. 3. 16三氯甲：皖

41、异戊醇，24L A. 4. 3. 17盼三氯甲烧2异戊醇，25: 24: I, A. 4. 3. 18 提取裂解缓冲液（pH8. O), TRIS 0. 050 mol/L，几EDTA 0. 050 mol/L. SDS 30 g/L用HCl或KOH调节pH值。A. 4. 3. 19 TE缓冲液（pH8. 0), TRIS 0. 010 mol汀，几EDTA0. 001 mol/L.用HCl或KOH调节pH值。A. 4. 3. 20 RNA酶溶液，RNAseA 10 mg/mL，冷冻干燥状态下，20 C保存。A. 4. 3. 21 70%乙醇溶液（C2H50Hl,20保存使用。A. 4. 3.

42、 22 乙酸御溶液CKC,日，02),3mol/L，用冰乙酸调节pH值J5. 2，不用灭菌（0.22 m膜过滤）。A. 4. 3. 23 玻璃珠，将直径为0.2 mm 0. 5 mm的玻璃珠放到浓硫酸中过夜，然后用灭菌水洗涤，在碳酸氢饵溶液中煮沸，用灭菌水洗涤，然后在真空干燥器中80干燥。A. 4. 3. 24 碳酸氢饵溶液CKHCO,l, 50 g/L, A. 4. 4 主要仪器和设备A. 4. 4. 1 珠子打击器，以100次min的敲打速度对2mL螺纹口的聚乙烯试管进行打击。A. 4. 4. 2 离心管，2rnL螺纹口聚乙烯试管。A.4.4.3 过滤装置，25mm直径玻璃纤维膜。A.4.

43、4.4 离心机，配备2ml，离心管的转子。A. 4. 4. 5 水浴锅或加热装置。A.4.4.6 真空干燥器。A.4.4. 7 涡旋器。A. 4. 5 提取步骤A. 4. 5. 1 测试样晶制备和样晶申微生物菌落的准备DNA提取前需分离微生物，有时微生物的分离要经过琼脂或液体培养基增菌。收获微生物后，可直接进行DNA的提取或20冷冻保存直到进行下一步处理。A. 4.5. 2 DNA提取10 a) 用玻璃纤维滤器收集真菌，用不含SDS的裂解液洗涤两次，将茵丝洗下并转移至2mL螺纹帽的离心管中，内装处理过的玻璃珠，600I，裂解液，600L盼三氯甲：皖异戊醇。b) 对于微生物菌群，细菌，真菌，酵母

44、或酵母样微生物，用不含SDS的lmL裂解液洗涤1次，然后10000 g 13 000 g离心10min，至少重复一次。然后用600L裂解液悬浮。转移至含有玻璃珠及盼三氯甲烧异戊醇的离心管中。c) a) I）后，以100次Imin的速率在珠子打击器上震荡lmin 2 min离心管，立即在65C温浴30 min 120 min, 10 000 g 13 000 g离心10min，转移上清液到新管中。（对于JE量PCR可温浴30min后，10000 g 13 000 g离心15min，转移上清至普通离心管中，加入RNA酶，至终浓度为0.001 mg/mL, 65。C温浴30min 90 min）。加

45、入乙酸饵至终浓度为0.3 mol/L, 混匀，加入I.2 mL乙醇。一20过夜或80保存lh。4条件下10000 g 13 000日离心15 min，用乙醇溶液小心洗涤DNA沉淀，干燥。用50L 100 I，水溶解DNA，如果20长期保存（5年以上），用TE代替水。GB/T 19495. 3-2004 B.1 范围附录B（规范性附录）PVP法提取DNA本方法适用范围广，尤其适用于富含多盼成分的样品。B. 2 原理本方法首先在sos和高浓度EDTA的情况下进行热裂解，裂解出的成分如多盼，多糖，新陈代谢成分和蛋白质以和PVP和乙酸氨结合方式从含有DNA的液相中除去。用乙醇沉淀的方法浓缩DNA并且除

46、去盐。B. 3 安全防护有机物处理在通风橱中进行。B.4试剂B.4.1 96%乙醇（C2H50H），在20使用和保存。B. 4. 2 异丙醇（CH,CHOHCH,)B. 4. 3 聚乙烯口比咯烧酬CPVP），分子量M 360 000 O；内在粘度CK值80JOO）。B. 4. 4 冰乙酸CCH,COOH)。B.4.5 37%盐酸CHCl)。B. 4. 6 氯化纳（NaCl)。B. 4. 7 Tris( hydroxymethyl) aminomethane TRIS CC, H, NO，）。B. 4. 8 乙二胶四乙酸工纳盐（Na2EDTA）。B. 4. 9 十二烧基磺酸纳SDS(C,H2号O

47、,SNa）。B. 4. 10 乙酸氨CNH,C,H,02）。B. 4. 11 70%乙醇溶液（C2H50H），在20的条件下使用和保存。B. 4. 12提取缓冲液（pH8. 0), TRIS 0. 2 mol/L. NaCl 0. 250 mol/L. Na2 EDT A 0. 025 mol/L. SOS 50g/L，用HCl或NaOH调节pH值。B. 4. 13 乙酸氨溶液CNH,C2H302), 7. 5 mol/L，用灭菌水溶解，0.22 m滤膜过滤。B.4.14 TE缓冲液CpH 8. 0), TRIS 0. 010 mo/L, Na2 EDTA 0. 001 mol/L，用HCl或

48、NaOH调节pH值。B. 5 设备和仪器B. 5. 1 离心机(10000 g) 0 B. 5.2 水浴锅或温浴。B. 5. 3 真空干燥器。B. 5. 4 冷冻干燥器。B. 5. 5 涡旋器。11 GB/T 19495. 3-2004 B. 6 提取步骤12 a) 称取0.25 g经过研磨或压碎或者液体材料到小容器中，加入lmL提取缓冲液，65搅拌l h，室温下冷却，随后将60mg PVP粉末和0.5体积的乙酸氮溶液与上清液混合，冰浴30 mm, b) 10 000 g离心JOmi口，将上清液转移的一个新的小管中。将裂解物和IX体积的异丙醇混合，-20放置30min。4条件下10000日离心10min，小心弃去上清液。c) 用2体积的乙薛溶液洗涤DNA沉淀2次。小心弃掉上清液（如果沉淀是松散状态，4条件下10000 g离心10min）干燥沉淀，用10011L水或TE缓冲液重新溶解沉淀。GB/T 19495. 3-2004 附录C（规范性附录）CTAB法提取DNAc. 1 范围本方法适用于提取植物及植物类产品中的DNA。本方法可以有效去除影响DNA质量的多糖类和多盼成分。本方法也适用于植物性食品。C.2原理本方法由CTAB热裂解、抽提（去除多糖和蛋白质）、异丙醇沉淀核酸及乙醇洗涤核酸等步骤组成。根据测试样品所含组分的性质，可采用相关的酶处理