GB T 8381-2008 饲料中黄曲霉毒素B1的测定.半定量薄层色谱法.pdf

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1、ICS 65. 120 B 46 中华人民春日国国家标准GB/T 8381-2008/ISO 6651 : 200 1 代替GB/T8381 1987 的测定饲料中黄曲霉毒素B，半定量薄层色谱法Determination of anatoxin B1 in animal feeding stuffs Semi-quantitative 蚀inlayer chromatographic methods 。SO6651: 2001 , Animal feeding stuffsSemi叮quantitativedetermination of aflatoxin Bl Thin layer chr

2、omatographic methods, IDT) 20合各11蛐21发布数码防伪中华人民共和国国家质量股督检验检班总局中国国家标准化管理委员会2009心2酬。1实施发布GB/T 8381-2008/ISO 6651 : 2001 目次前言.皿1 范围.2 规范性引用文件-3 原理4 试剂-5 仪器-6 采样7 分析步骤-8 计算和结果表示89 实验室间试验810 试验报告8附录A(资料性附录)实验室间试验结果9I GB/T 8381 2008/1S0 6651 : 200 1 目司百本标准等岗采南岳际挥准ISO6651 :2001(饲料中黄曲霉事京队的半定最测文般)。本标准等同翻译ISO6

3、651 :2001，为便于使用，做了F列编辑性修改:标准中文名称修改为饲料中黄曲霉毒素B1的测定半定量薄层色谱法k删除了国际标准的前言;国际标准改为本标准;色潜法H用文件中，用GB/丁20195动物饲料试样的制备押代替ISO6498; 用文件中，增加GB/T14699.1饲料采样;只才阳2巾的脱开方向符号进行了更正，将1改为II，Il改为1。本标准代替GB/T8381-1987饲料中黄船霉毒素岛的剖定方法上本标F能与GB/T8381- 1987相比，主要变化如F:条款中，删除黄曲霉毒素码标准港被割备时纹器校王内容，并增加黄曲霉毒素在一月:脱标准搭液制备与浓度描定;的撬开娟种类由爵种增至五种;向

4、j搏层色谱法中，增加不同体积的标准溶渣和捍品需攘的点样点;向薄层色藩法中，减少辘黯毅的数量，并且点样的分布方式不同;校翻中增加静犀扫攒仅荧光法z确证试按中增如攘攘推黯i这罄。:$:标准的院法人是资料姓择:录a本标准串全国锵料工.yk标准住技术委员会提出并归口。本标鼓起草单位z在算有喜爱生物研究挺有限责在公司。本称雄主要起草人:蒜晓黎、李科东、袁建兴、杜妹莲。本标准于1987年茵次发布，本改为第-7X修订。噩GB/T 8381-2008/ISO 6651 :2001 锅料中黄曲毒毒素矶的测地半定量薄层色谱法1 黯围本样准规定了制料中黄曲辑毒素在的两种测定方法，并只能用于半定赣测定。J本都准中的方

5、法人适用于袖将如抽抨柏、花生、褥子仁、亚麻仁、大豆、棕榈仁、木薯淀粉、玉米梧、谷类和谷类制品、豌豆粉、土豆渣和土豆粉等单一饲科产品。当按照方法A翻定上述某个单一特科受干扰时，建议使用方法已。本标准中的方法B适用于配合饲料以及上述未提及的单一饲料。*方法不适用于含桔捕植的钢料编2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的在周而成为本标准的条款。凡i是法吕裹的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订般均不边用于本标准，然而，鼓始接据本标准达成拚议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本乱是不注目期的引用文件，其最薪藏本选用于本标准。GB/T 14699. 1饲料采样CGB/T1469

6、9.1 2005 , ISO 6497 :2002 ,IDT) GB/丁20195动物辑料试样的制备(GB/丁20195-2006，ISO6498:1998 ,IDT) 3 黯理试样中黄曲霉海京Bl经三章在申皖提取、过盖章，硅股柱纯住，故缩，用一定体手吴三氯甲:烧成苯乙黯提合液潜解残渣。用单向薄层色谱法战双向薄层色谱法进行试穰启析分离。在紫外灯下栓查色i费了夜光斑点，在同一故土，试攘与己知量标准黄酶草草毒素Bl比较，琦目割法或薄层扫描仪荧光法揭定黄曲Bl含量。以路成半缩醒衍生物来费证黄曲嚣毒素乱。4试1flj在分析中使用确认为分析纯的试挠和亲铺水或去离子水或相当先度的水。4. 1 三氯甲烧z用

7、0.5%-1.0%的95%乙醇稳定。4.2 lE己载。4.3 克水乙黯2元过氧化物。4.4 苯恤乙蜻(98十2)混合摄:98mL革与2mL乙黯握合。4.5 三雪在甲:皖-甲喜事(97十3)11昆合攘:97mL三氯甲辑与3mL甲醇混合。4.6 展开剖z使用普盖股开槽，展开槽内黯衬上攻水纸，使展开攫被殷开剂饱和。4.6.1 三氯甲;皖丙酣(90+10)提合液:在未链和展开槽肉，90mL二三氧甲挠和10mL丙隅混合。4.6.2 乙醒甲醇伽水(96十3个1)混合攘t在未饱和展开播内，96mL乙醋、3mL甲醇和1mL水?昆合。4.6.3 乙酣甲醇哪水(94十4.5十1.5)撮合液:在饱和展开槽内，94m

8、L乙醋、4.5mL甲醇和1.5 mL水温合。4.6.4 三集甲:域也甲醇(94十的混合液z在键在展开槽内，94mL二三氯甲:院和6mL甲醇混合。4.6.5 三氯甲炕也甲醇(97十3)棍合液z在梅和展开槽内，97mL三氯甲:皖在3mL甲醇撮合。4. 7 磁肢z柱层析肩，0.05mm-O. 20 mm粒径。4.8 硅腋G:薄层色请用。GB/T 8381-2008/ISO 6651 :2001 4.9 酸洗硅藻土m4.10 元水硫酸饷04. 11 三氟乙酸。4. 12 惰性气体z如氮气口4.13 50%蔬酸潜液体表分数).4. 14 O. 1问/mL黄爵霉毒素Bl标准攘攘:周三氯甲统(4.1)或苯唰

9、乙黯混合液(4.4)配制。警告一-冀汹霉毒素是高致摇性辑嚣，寂十分小心处理依下列各项制督和核对黄曲霉毒素瓦洛滚。4. 14. 1 储备液的制备与法度测定用三雪在甲烧(4.1)或苯乙腊梅合撒(4.4)配制的黄曲Bl际准潜攘，其故8g/mL 10 p.g/mL之肉，那紫外分光光度计(5.的，在330nm和370nm之间测定吸收光谱m对黄曲草草毒素Bl三氯甲娃帮液，在363nm处J定吸光度值(A)0或对黄曲摇晦京日1苯乙踊混合帮攘，在348nm娃搜号曼先度筐c的。黄曲霉毒素岛的浓皮数倍以做克每毫升附/mL)表示，按式(1)或式(2)计算。a) 黄曲扫黄B1兰氯甲;皖潜藏z黄曲每毒隶日1辄甲镜常被散度

10、Bl苯乙睛说含溶液z黄曲霉毒素紫啕乙盾11合禧攘攘皮312 X A x 1000 . ( 1 ) 22 300 ?臼fe、nu一nu nu-i一-nv 一部A-QJ X-1晶内4咱EA鸣。4. 14.2 稀辈辈在避光条件下，将储备接(4.14.1)适当稀释孟0.1g/mL冀噩霉毒素已i际歌攘攘。如果在4c 冰箱贮存，此荒草液两周内是稳定的。4. 14.3 储备磁色谱纯度试验取5L8 l.lg/mLlOg/mL黄曲尊毒素BJ标准溶液(4.14.1)点加于搏脏板t(5.门，按7.5.1 层斩，在紫外主TF色谱只冕连点，在摞点处无明显员先。在15用于定性试璋的羹蘸蓓毒案Bl和(晃4.14警告攘攘为约

11、含O.1附/mL黄曲莓毒紊乱和县的三氯甲:皖(4.1)或苯乙黯滋合溶攘(4.的。所给出的故度为指导性浓度，应晦节两种黄曲草草莓寰宇在度出获得格陆传荧光强度(7.5.口。5 仪器5. 1 研蘑税/混合机。5.2 分挥第2孔径1.0 mm.详见ISO565) 0 5.3 振溺器或磁力援拌毛TL5.4 位潜玻璃柱t内径22mm，长300mm, F带策能簸乙:罪活塞，上有250mL JJC攘器。5.5 旋转真空浓缩器z带500mL圆底烧瓶。5.6 薄f这位谱设备z薄层板刊.7);点样器(毛细管成撒最移液器);展开槽在黯于疏酸溶滚(4.13)援色提喷雾器a5. 7 慧辍支璃薄层援:200m口1m3始og

12、砖E鼓交(任4.8的于二五三兔题中，J主如116臼omL水，J主细n瓶塞振摇1min，涂布板上，0.25mm 膊，空气中干;躁，然黯肚存于含硅膛的干;操器中，黑司110C捂住1h。也可黑具有相闻性霞的预制板。5.8 紫外光灯z波长360nmo 1) ISO 565 试验用筛金属丝织阿布、多孔金属板和电加工成形的薄板孔径尺寸的公称2 G/T 8381-2008/ISO 6651 : 200 1 ;可距薄服板10cm时，照射强度应使1.0 ng黄曲警告一一紫外先对眼睛有嚣，应慧防护锻65.9 紫外分先光度计。5. 10 薄层扫描仪:可荣党栓i!tl(可选)0 5. 11 槽状滤纸。5.12 10.

13、0 mL带聚乙:精蔬试管。5. 13 500 mL丑角瓶:具磨口或璃塞。5.14 50 mL静液臂。5. 15 分析天平G6 采样按照GB/T14699.1采集实验室样品a7 分析步囔7. 1 试样制备Bl斑点能被清晰分辨。7. 1. 1 如果样品脂肪含量去想过5%，在精碎之前用石油路建脂.如果经魏菇，分析结果以未脱脂样品计。7. 1. 2 粉碎实验室窍品，全部通过分样筛(5.2)，充分混合，详见GB/T20195. 7.2 试料称最割备i式样50g，精确至0.01缸，囊子赞形瓶(5.1幻中.7.3 提翠主n25 g硅毒疆土(4.的，用盘筒准确董取25mLj(、250mL三氯甲:提(4.1)歪

14、试辑(7.2)中，加瓶筝，黯撮葫设各(5.3)振摇或m拌30min，通过槽较撩纸(5.11)过墟，弃10mL辑法液，随后至少校集50 mL攘攘n7.4 柱纯化7.4. 1 柱的制备加2/3柱体糕的主氯申;皖(5.的到愚析校中，翅5g硫酸鳞(4.10)，使航酸锦层表面平整，分次如人10 g础胶(4.7)，如有气混时，小心攒动，静置15min，再小心地加10g碰酸锅(4.10) ，打开活塞，让液体流出，直至被体恰在疏离去销嚣的七表酶，关部活墓。7.4.2 纯化用移液管(5.14)吸取50mL q支集的眼模(7.3)至250mL锥彭瓶中，加100mL己统(4.幻，混合，提混合被定量地转移至层析柱巾，

15、用正己:院提擦锥形瓶，并伪i入柱中，打开活寨，使液体以8mL/min-12 mL/min流速流出，直至撞体在硫酸镇层的上表面，关民活擦。加100mL乙醋(4.3)到柱中，再打开活塞，直到液体流出至疏载铀层上表黯弱弃去流出接体。在整个操作过程中，保证柱不干。用150mL三氯早就嘲甲醇?是合摄(4.5)洗膜柱子，收集全部洗鳞穰到500mL撬转蒸发瓶(5.5)内，那旋转蒸发器在情性气体付.12)保护下，50Cl其下减压葬在铺至于3如果粟转蒸发器不适窍，可加助沸茂，在水浴中蒸发至于。照二三氯甲:民性.1)或苯-乙腊?是合摄(4.4)转移残留辑至10mL试管(5.12)中，置于水播中，通惰性气体(4.1

16、2)，再蒸发此榕液。用三氯甲!皖(4.1)或苯巾乙腊?昆合液(4.4)定容至2.0mLD 7.5 薄墨色潜7.5. 1 方法A一单l句薄黯f!谱法7.5. 1. 1 选择展开撰预先配制选择的溶剂(4.6.1、4.礼2、4.6.3、4.6.4或4.6.日，保证黄曲梅毒素B1与鸟在薄层握主3 GB/T 8381-2008/ISO 6651: 200 1 展开后完全分离，其结果也取决于所用薄层板的批号。点25L定性溶液(4.15)在一薄层板(5.7)上，按7.5.1.2展开，挥发，照射。用合适的溶剂会产生两个明显点。7.5. 1. 2 操作步骤取TLC板，在距薄层板下端30mm的基线上用毛细管或微量

17、注射器点样，每点间隔20mm，黄曲霉毒素BI标准溶液和试液的点样体积如下:一一10L，15L，20L，30L，40L黄曲霉毒素也标准溶液(4.14); 一一10L试液(7.4.2)，在同一点，加20L黄曲霉毒素BI标准液;一10L，20L试液(7.4.2)。在暗处用所选择的展开剂展开(7.5.1.1)。从展开槽中取出板，置暗处蒸发溶剂，然后在紫外灯下检查，板置于灯(5.8)10cm处，黄曲霉毒素也斑点显蓝色荧光。7.5.2 方法B一一双向薄层色谱法7.5.2. 1 点样(见圄1)在板上画两条直线平行于两个毗邻的边，分别距每边50mm和60mm，建立溶剂前沿迁移限线，用毛细管或微量注射器点下列溶

18、液:在A点，20L试液(7.1.2);在B点，20L黄曲霉毒素BI标准溶液(4.11); 在C点，10L黄曲霉毒素BI标准溶液(1.11); 在D点，20L黄曲霉毒素BI标准溶液(4.11); 在E点，40L黄曲霉毒素BI标准溶液(4.14)0 用空气或惰性气体慢慢吹干，斑点的直径约5mmo 单位为毫米E EN ;+: E 半D北cI A B r-一一米-一一一一-一一一一一一一一一一兴一一-130 50 ()咀EN 圄1点样示意图4 G/T 8381-2008/ISO 6651 : 200 1 7.5.2.2 晨开克辑1)在暗娃，黑黑开揭(4.6.3)(在键在展开播中约1cm蹲按方向I展开至

19、溶弗j前攒限钱，取出展开槽中板，挥干，室温放量是在精赴3至少15mn, 然后在暗处用展开剂(4.6.1)(在非坦和展开槽中约1cm霹浩方向主展开至潜1f1j前浩限线，从展开槽中取出板，在室温、暗处挥干。7.5.2.3 色谱解听(见回2)将薄层板置于紫外灯(5.的10cm处检查色谱，标记队C、D、E标准蓓被中黄般无斑点。逼过E、D、C和总瞄两条分别平行于两个展开方向的假想线，相互垂直井相交子P点，P点为点样A中黄曲霉毒紊乱荣充王震点的理论位置，但果实际J:点样A中黄曲霉毒素队的荧光斑点可能位于区的蓝色荧Q点，使得Q点分主导与C点、8点连成普直线成1000免。1ll飞t l 1 ?飞I ;飞i飞i

20、飞1 1 1 口已喃喃喃喃一兴一一自A lt !飞黯2色灌露新7.5.2.4 附助色情在一新板上，画两条直线平行于两个毗邻边，如图1所示，在人点，点20L试被(7.4.2)，整如点B1标准搭被(4.14)，按7.5.2.2展开，在紫外灯下检查色谱并核查:中的黄曲霉毒素B1斑点与特准需液中的黄曲霉部紫B1斑点叠加;的荧尧强度比第一块援Q点处的黄曲霉毒素Bl斑点荧光强度更强。7.6 检翠37.6. 1 目醋法7.6. 1. 1 方法A通过试液荧光斑点与标准潜液荧光王震点比较，测定试被中黄磁缝毒素乱的量。试掖加标准带液的点所在僻的荧光应该比10L试液点更强，并且应是只显示一个斑点，如果10L试攘给出

21、的荧光强度反而比40fiL标准溶液更强，在3重新滞后患析之前，应该用三氯甲就(4.1)或苯乙踌混合摄付.4)稀释试攘10倍或100f击。E GB/T 8381叫阳-2008/ISO6651 : 2001 7.6. 1.2 方法8通过试穰至在点荧光强度与C、D和E挥准潜液的斑点紫光比较，那定试攘中黄曲霉毒素Bl的血。如果20L试攘所墨荧光强度比40L样攘攘攘更强，在建新进钉薄层层析之前，用三氯甲烧(4.1)或苯m乙膳混合法(4.4)稀释武滚10告或100窜。7.6.2 薄靡扫描钱黄先法365 nm激发波长，443nm发射波长T，用摇钱。.10)拴费1黄曲霉毒素Bl在点的黄先强度。在用方法A的情况

22、下，通过比较标准潜藏的斑点荧光强度，翻定试滚王军点中黄菌霉毒素乱的最号在用方法B的情况下，通过比较标准溶液C、D和芜的斑点荣光强度，溜走过液斑点中冀最Bl的主性。7.7 黄曲霉毒素B1确证试验7.7.1 遥酣F在能酸推理1试验(7.7.2)验证鉴定试液中的黄曲草草毒素息，如果测试结果为阳性，用有娘的确证试鼓(7.7.3)0如果藏最最费1试验结果为阴性，这种情况提法黄曲霉毒素孔不存在，不需要在实施有效的确证试载。7.7.2 载酸撞jll试重喷盛雪麦潜藏(4.13)在7.5.1或7.5.2技得自告能转为黄色。，在紫外好下，黄曲霉毒素Bl荧光斑点应由脏7.7.3 确证试验7.7.3. 1 半Z酷住黄

23、曲霉毒素弘的影成(赣酶霉毒素B2.)时单一或有轻撤颜色的饲料，用7.7.3.2锚瑜的羊肉薄墨色谱方法。对单一颜色钝科、配合饲料或有疑问情况下，用7.7.3.3描述的政向7.7.3.2 单向薄层色谱法在握(5.7)上划，直线将板分成削个均等份，在每一份上，距康边绿20mm娃点样，点距15mm，卖出霉毒素Bl标准溶液和试液点样体积如f:25L黄曲霉辛苦素Bl标准榕液(4.14) ; 武液(7.4.2)的体权含持2.5ng黄曲霉毒素B1;25L黄曲霉毒紊乱标椎溶液(4.14)，在此点上叠加点试被(7.4.2)，相当于2.5ng黄曲霉毒素在的体载。在其中一个1/2被上，在先前点的斑点上是加点1L或2L

24、三氟乙酸(4.11)，在室温下用空气流于;躁。在暗处，用一种展开荆(4.6)撬开嚣，斩，事先选择好此景开剖，溶剂系统应保证半乙酷化黄曲霉毒素民与干扰辑清斯分菇，溶荆前括应达120mm处。在暗处挥发潜剖，然脂将磁酸播被(4.13)暖在没有居二簇乙酸经理的援部分，在紫外灯下检查薄层板。黄曲霉毒素Bl鉴别确证，如果a) 试液中黄由磁带絮Bl衍生物的Rr值与标准蓓攘的Rd章相b) 标准溶液加试液中黄曲梅毒素也衍生辑荧光，比试壤中黄曲嚼毒素也能生物在j荧光更强。由于试液荧光斑点与半乙航化黄曲莓毒素Bl荧光斑点有指间Rf链，可能导致色谱的假捂住于挠，这些现象用碗酸扯踵的极部分检查。如果有疑问，应该用双向薄

25、摆色谱法(7.7.3.3)确证。5 GB/T 8381-2008/ISO 6651 : 2001 7.7.3.3 双国盖章愚色谱法(见嚣37. 7. 3. 3. 1 点辛辛在板(5.7)上划两条1L钱，平行于两注边缘(距得边60mm)，建立潜部茹沿迁移限钱，患毛细管或微量注射器点下列榕液:在A点:点试液(7.4.剖，其钵积中相当于含2.5ng黄曲霉毒素且，滴加1L2L主策乙酸(4.11); B点和C点:点25L黄曲霉毒素B1都准榕液(4.14)，痛加三氟乙酸(4.11)。室温空气捷干蝶。7.7.3.3.2 撬开如雷3所示，在暗娃用展开jfIJ(4.6.2只在非饱和槽1cmP事处)按方向I撬开荒

26、溶剂前沿限钱，从槽中取出援，在暗处室溢于:操5mino 在暗处用展开知(4. 6. 1川在非链和槽1cm委主蛙)按方向在展开荒前沿限载，取出板，在室温下干蝶。7.7.3.3.3 色潜解析在紫外好(5.的下楼变色谱，核查Tylf特枉:a) 接示来自点在C处(方向I移动)和J点在8娃方向在移动的标准溶液中学乙散化黄曲莓Bl蓝色荧光斑点，问时显示有未与三簸乙酸反应的黄曲苍苍毒素B1弱的蓝色荧光斑点。b) 11边放点在人处试班中类叙于a)描述的斑点，这唤点的位置通过点在B在C处的标准溶接产生的斑点鉴别，来白试壤中的半乙捷生化黄曲革藤紊乱鼓点荧光强度与点在B和C娃特准榕攘中的应该是可比较韵。再立位为毫米

27、20 CN :=: j气8 。时140 留3点样和撤黯7 GB/T 8381 2008/1S0 6651 : 200 1 7.8 检测数量相同试验样品进行重复栓验a8 计算和黯兼若是来8. 1 器法这样中卖应在的含量(X1)以镀克每千克(!J-g/kg)表示，按式(3)计算:式中zc 黄曲霉毒素Bl林?能静液(4.14)的故度(约0.1问/mL)，单位为做克每毫升(g/mL); m 柱纯化用提取液的体积所相当的试料质量(10.0g) ，单位为克(g); V j 提取液最终体积(必要在时进行稀释)，单位为微升口;矶，V3-一分别为试样体帜和1具有类似荧光强度棕准静攘的体棋，单位为数升句L)o8.

28、2 薄层扫描仪荧光法试挥中黄曲霉毒素鼠的食最(Xz)以徽克每千克g/kg)表示，按式的计算:X少=mj XV1 一一mXVz 式中=. ( 3 ) ( 4 ) ml 以z体积诗算，从激i定中黠算出的提取被王在点中黄白嚣莓;京队的质鼓，单位为纳克(ng);V 提取液最终掉职必要时考虑稀释)，单位为微升(L); m 柱纯先用提取液的体农Jifr相当的试料质量00.0g).单位为克句); V2 点到极上的提取液体积(10L成20L).单位为散升(L)9 实验室闰试验实验室间试验方法精髓度汇居于附录Ao实验室间试垂获得的最可以不适理于黠录A未到出的浓度范围和基质。10 试验报告s 试验摄告应绘出的内容

29、:样品罢走去告所有必要结蒜;一一如果已知，使娟的采样方法z 使用本标准提及的试输方法人或方法B;捡罪方法(自测法或薄居扫描仪荧光法); 一在本标准中没有详细说明的所有操作方法或认为选择可能影响试验结果的任何事件的攘述手一一试验结果。GB/T 8381-2008/ISO 6651 :2001 酣录A(资料性lfM景实验室闰试磕结果配合饲科(方法白的实验室问试验，其中两组究戚在国际水平(No.l和No.衍，A.l E汗示a试毒室2中11个实验策也接方法人分析了样品，其饲料组成活合于方法A，用自测法济获得的数器与方法8类埠。表A.1实撞童问试翰摇果统计试验数2 参加实8贫寒的数目23 11 (g/k

30、g) 162.7 25.4 室主复性标准虫在(S铲)/Cg/kg)16.9 2. 7 系数/%10 1I 重复性限(2.83S，)/(严g/kg)47.8 7.6 )/g/泣g)45.2 6.8 济现性变异系数/%28 27 再现做限(2.83SR) /C月/kg)12忌。19.2 3 13 13.4 13 4.8 4.0 30 11. 3 果如描荧光中华人民共和居国家标准缉料中黄曲蹲着毒素岛的测定半定量薄黯色谱法GB/T 8381 2008/1506651 :2001 * 小国标准出版社出版发行北京复兴门外旦河北街16号邮政编码:100045 网力 电话:6852394668517548 中阔标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争导开本880X12301/16 印张l字数21千字200年1月第一版2009年i月第一次印刷美书号:15506在.1-35441 定价16.元如有王在装革提销自本社发行中心调换版权专有侵权必究举摄毫话:(010)68533533GB/8381叩2008FOONH 二$02OONi伺同碍。