SN T 5406-2021 进口食用植物油中转基因成分检测方法.pdf

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1、I C S 6 7 . 0 5 0 C C S X 0 4 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 进 口 食 用 植 物 油 中 转 基 因 成 分 检 测 方 法 D e t e c t i o n o f g e n e t i c a l l y m o d i f i e d c o m p o n e n t s i n e d i b l e v e g e t a b l e o i l f o r i m p o r t ( 报 批 稿 ) 2 0 2 1 - 1 1 - 2 2 发 布 2 0

2、2 2 - 0 6 - 0 1 实 施 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 发 布 以正式出版文本为准前 言 本 文 件 按 照 GB / T1. 1 2020 和 GB / T20001. 4 2015 给 出 的 规 则 起 草。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任。 本 文 件 由 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 提 出 并 归 口。 本 文 件 起 草 单 位: 中 华 人 民 共 和 国 广 州 海 关、 中 华 人 民 共 和 国 南 京 海 关、

3、中 华 人 民 共 和 国 天 津 海 关、 中 华 人 民 共 和 国 青 岛 海 关、 中 华 人 民 共 和 国 上 海 海 关、 中 华 人 民 共 和 国 深 圳 海 关。 本 文 件 主 要 起 草 人: 董 洁、 刘 津、 王 毅 谦、 梁 颖 婕、 王 仲 敏、 孙 敏、 李 想、 潘 广、 龙 云 凤、 贺 艳、 高 宏 伟、 尹 璐、 高 东 微、 李 荀、 陈 文 锐。 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准以正式出版文本为准进 口 食 用 植 物 油 中 转 基 因 成 分 检 测 方 法 1 范 围 本 文 件 规 定 了 进 口 食 用

4、植 物 油 中 转 基 因 成 分 的 定 性 检 测 方 法。 本 文 件 适 用 于 初 榨 大 豆 油、 菜 籽 油、 玉 米 油 和 棉 籽 油 中 转 基 因 成 分 实 时 荧 光 PCR 定 性 检 测。 其 他 类 型 的 食 用 植 物 油 可 以 参 照 执 行。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。 其 中, 注 日 期 的 引 用 文 件, 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件; 不 注 日 期 的 引 用 文 件, 其 最 新

5、版 本( 包 括 所 有 的 修 改 单) 适 用 于 本 文 件。 GB / T6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 GB / T19495. 2 转 基 因 产 品 检 测 实 验 室 技 术 要 求 GB / T27403 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 验 3 术 语、 定 义 和 缩 略 语 3. 1 术 语 和 定 义 本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。 3. 2 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。 adhC : 乙 醇 脱 氢 酶 C 基 因( a l coho lde

6、hyd r ogena s eCgene ) ba r : 磷 化 麦 黄 酮 乙 酰 转 移 酶 基 因( phosph i no t hr i c i na c e t y l t r ans f e r a s egene ) CP4 -EPSPS : 根 癌 农 杆 菌 CP4 蛋 白 基 因 和 5 - 莽 草 酸 - 3 - 磷 酸 合 成 酶 基 因( A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s s t r a i nCP4P r odu c t : he r b i c i d et o l e r an tf o rmo f

7、5 - e no l py r uvu l s h i k ima t e - 3 - pho s ph a t es yn t h a s e ) CruA : 十 字 花 科 种 子 储 藏 蛋 白 基 因( Cruc i f e r i nAgene ) GOX : 草 甘 膦 氧 化 还 原 酶 基 因( g l ypho s a t eox i do r educ t a s egene ) hmgA : 高 移 动 性 蛋 白 家 族 基 因 A ( h i gh -mob i l i t y - g r oupgeneA ) np t I I : 新 霉 素 - 3 - 磷 酸

8、转 移 酶 基 因( neomyc i n - 3 - pho spho t r ans f e r a s egene ) pCaMV35S : 花 椰 菜 花 叶 病 毒 35S 启 动 子( 35Sp r omo t e rf r omc au l i f l owe rmo s a i cv i rus ) pFMV35S : 玄 参 花 叶 病 毒 35S 启 动 子( 35Sp r omo t e rf r omamod i f i edf i gwo r tmo s a i cv i rus ) tE9 : 源 于 豌 豆 二 磷 酸 核 酮 糖 羧 化 酶 基 因 终 止 子(

9、 t e rmi na t o ro fr i bu l o s e - 1 , 5 - b i spho spha t ec a rboxy l - a s eE9genef r ompe a ) tNOS : 源 于 农 杆 菌 的 胭 脂 碱 合 成 酶 基 因 终 止 子( t e rmi na t o ro fnopa l i nes yn t ha s egenef r om A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n ) 1 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准4 方 法 提 要 采 用 特 异 性 的

10、 方 法 对 食 用 植 物 油 中 基 因 组 DNA 进 行 富 集、 提 取 和 纯 化, 使 用 脂 溶 性 载 体 上 的 DNA 亲 和 配 体 特 异 性 结 合 食 用 植 物 油 中 残 留 DNA , 并 形 成 配 体 -DNA 复 合 物, 该 复 合 物 被 吸 附 柱 内 吸 附 膜 上 的 亲 和 配 基 捕 捉, 利 用 工 具 酶 A 切 除 脂 溶 性 载 体 并 释 放 富 集 的 DNA , 经 释 放 的 DNA 经 微 量 离 心 柱 浓 缩 和 纯 化; 采 用 实 时 荧 光 PCR 技 术 扩 增 食 用 植 物 油 中 基 因 组 DNA 特

11、 异 性 的 内 源 基 因 和 外 源 基 因 片 段, 并 根 据 检 测 结 果 判 断 样 品 的 核 酸 中 是 否 含 有 转 基 因 成 分。 5 试 剂 和 材 料 除 另 有 规 定 外, 实 验 用 水 应 符 合 GB / T6682 中 一 级 水 的 规 格, 所 有 试 剂 均 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂。 5. 1 异 丙 醇。 5. 2 无 水 乙 醇。 5. 3 食 用 植 物 油 DNA 提 取 试 剂 1) : 见 附 录 A 。 1 ) 重 鼎 ZD-TG- 39 - 15 食 用 植 物 油 DNA 提 取 试 剂 盒 是 适 合 的 市 售

12、产 品 实 例。 给 出 这 一 信 息 是 为 了 方 便 本 文 件 的 使 用 者。 如 果 采 用 其 他 产 品 提 取 食 用 植 物 油 中 植 物 基 因 组 DNA , 经 本 文 件 规 定 的 荧 光 PCR 检 测 可 以 得 到 相 同 或 更 好 的 检 测 效 果, 经 实 验 评 估 后 可 以 使 用 这 些 等 效 产 品。 5. 4 TaqMan 实 时 荧 光 PCR 预 混 液: T a qDNA 聚 合 酶、 PCR 反 应 缓 冲 液、 氯 化 镁、 dNTPs ( 含 dATP 、 dUTP 、 dCTP 、 dGTP ) 和 UNG 酶 按 比

13、 例 配 制 的 溶 液。 5. 5 引 物 和 探 针: 按 照 表 1 选 择 靶 标 基 因, 靶 标 基 因 的 引 物 探 针 序 列 见 附 录 B 。 表 1 进 口 食 用 植 物 油 转 基 因 成 分 检 测 的 靶 标 基 因 植 物 油 种 类 内 源 基 因 外 源 基 因 大 豆 油 Le c t i n pCaMV35S 、 tNOS 、 CTP2 -CP4 -EPSPS 菜 籽 油 Cr uA pCaMV35S 、 pFMV35S 、 GOX 、 tE9 棉 籽 油 adhC pCaMV35S 、 tNOS 、 np t I I 玉 米 油 hmgA pCaMV

14、35S 、 tNOS 、 np t I I 、 ba r 6 仪 器 和 耗 材 6. 1 离 心 机: 离 心 力 12000 g , 转 子 适 配 50mL 离 心 管 和 1. 5mL 离 心 管。 6. 2 涡 旋 混 匀 仪。 6. 3 恒 温 干 燥 箱/ 培 养 箱: 531 。 6. 4 实 时 荧 光 PCR 仪。 6. 5 生 物 安 全 柜。 6. 6 超 低 温 冰 箱: -701 。 6. 7 单 道 移 液 器: 2 L20 L , 10 L100 L , 50 L200L , 100 L1000 L , 500 L5000 L 。 6. 8 无 菌 离 心 管:

15、 50mL 、 1. 5mL 、 0. 5mL 和 0. 2mL 。 2 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准7 试 样 制 备 按 照 GB / T19495. 7 制 备 的 实 验 室 样 品 进 行 试 样 制 备。 实 验 室 样 品 体 积 1000mL , 充 分 混 匀, 移 取 100mL 用 于 植 物 基 因 组 DNA 提 取 纯 化。 凝 固 或 流 动 性 较 差 的 样 品, 加 热 至 3540 , 待 样 品 全 部 溶 解 混 匀 后 再 取 样。 8 植 物 基 因 组 D N A 的 提 取 纯 化 8. 1 在 100mL

16、 试 样 中 加 入 200 LDNA 结 合 液, 涡 旋 混 匀 后 分 次 将 全 部 液 体 转 移 至 套 有 50mL 收 集 管 的 max i 吸 附 柱 中 并 以 5000g 离 心 2mi n , 每 次 移 取 试 样 体 积 不 超 过 15mL , 每 次 离 心 后 取 出 max i 吸 附 柱、 弃 去 收 集 管 中 离 心 过 滤 的 油 液 并 将 max i 吸 附 柱 重 新 套 回 收 集 管。 8. 2 全 部 试 样 过 滤 完 成 后, 向 max i 吸 附 柱 中 加 入 5mL 异 丙 醇 并 以 5000g 离 心 5mi n 。 弃

17、 去 收 集 管 中 的 离 心 滤 液 并 将 max i 吸 附 柱 重 新 套 回 收 集 管。 重 复 本 步 骤 一 次。 8. 3 将 吸 附 柱 套 在 新 的 50mL 收 集 管 中, 在 53 恒 温 干 燥 箱 中 敞 口 直 立 静 置 10mi n 除 去 残 余 的 异 丙 醇。 8. 4 按 照 每 个 试 样 添 加 溶 液 UT600 L 和 工 具 酶 A20 L , 在 1. 5mL 离 心 管 中 加 入 适 量 的 溶 液 UT 和 工 具 酶 A , 配 制 酶 消 化 液, 并 涡 旋 混 匀 后 在 53 恒 温 干 燥 箱/ 培 养 箱 预 热

18、 3mi n 。 8. 5 向 max i 吸 附 柱 的 膜 中 央 位 置 移 入 预 热 的 酶 消 化 液, 旋 紧 收 集 管 盖 后 直 立 静 置 孵 育 30mi n 。 孵 育 结 束 后 以 5000g 离 心 5mi n , 弃 去 max i 吸 附 柱。 8. 6 将 收 集 管 中 离 心 过 滤 的 液 体 移 入 新 的 1. 5mL 离 心 管 中, 加 入 60 L 溶 液 AC , 颠 倒 混 匀, 再 加 入 660 L 异 丙 醇, 再 次 颠 倒 混 匀, 静 置 15mi n 。 以 12000 g 离 心 10mi n 。 8. 7 小 心 弃

19、去 全 部 上 清 液, 向 管 底 加 入 200 L 溶 液 BJ , 静 置 5mi n 后 用 枪 头 轻 柔 地 吹 打 润 洗 管 内 壁 离 心 沉 淀 部 位 数 次, 涡 旋 混 匀 管 内 液 体, 再 加 入 100 L 无 水 乙 醇 涡 旋 混 匀。 8. 8 将 全 部 液 体 移 入 套 有 1. 5mL 收 集 管 的 微 量 离 心 柱 中, 以 12000 g 离 心 2mi n 。 检 查 微 量 离 心 柱, 如 有 残 余 液 体 应 增 加 离 心 时 间 使 全 部 液 体 离 心 过 滤。 8. 9 弃 去 收 集 管 中 离 心 过 滤 的 液

20、 体 并 将 微 量 离 心 柱 重 新 套 回 收 集 管 中, 向 微 量 离 心 柱 的 膜 中 央 位 置 移 入 200 L 溶 液 W2 , 以 12000 g 离 心 1mi n , 弃 去 收 集 管 中 离 心 过 滤 的 液 体。 再 次 按 照 前 述 方 法 用 溶 液 W2 洗 涤 过 滤。 再 次 弃 去 收 集 管 中 离 心 过 滤 的 液 体 后, 以 12000 g 离 心 2mi n 甩 干 残 余 的 液 体。 8. 1 0 将 微 量 离 心 柱 套 在 新 的 1. 5mL 离 心 管 中, 向 微 量 离 心 柱 的 膜 中 央 位 置 移 入 2

21、0 L 溶 液 TE , 静 置 3mi n , 以 12000 g 离 心 2mi n , 得 到 DNA 提 取 物。 8. 1 1 DNA 提 取 物 贮 4 备 用, 有 效 期 为 14d 。 9 实 时 荧 光 P C R 9. 1 阴 性 对 照、 阳 性 对 照 和 空 白 对 照 的 设 置 9. 1. 1 阴 性 对 照: 内 源 基 因 的 阴 性 对 照 为 其 他 植 物 物 种 的 基 因 组 DNA , 外 源 基 因 的 阴 性 对 照 为 非 转 基 因 同 一 植 物 物 种 的 基 因 组 DNA 。 9. 1. 2 阳 性 对 照: 含 有 靶 标 基

22、因 的 植 物 基 因 组 DNA 或 人 工 合 成 的 质 粒 DNA 。 9. 1. 3 空 白 对 照: 包 括 DNA 提 取 时 的 提 取 空 白 对 照( 以 水 代 替 样 品), 以 及 PCR 反 应 时 的 试 剂 空 白 对 照( 以 水 代 替 DNA 模 板)。 3 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准9. 2 反 应 体 系 反 应 体 系 配 制 见 表 2 。 每 个 样 品 设 置 2 个 平 行。 表 2 荧 光 P C R 反 应 体 系 试 剂 名 称 工 作 液 浓 度 反 应 体 系 终 浓 度 10PCR 缓 冲

23、液( 不 含 氯 化 镁) 10 1 氯 化 镁 溶 液 25mmo l / L 2. 5mmo l / L dNTPs ( 含 dUTP ) 各 2. 5mmo l / L 各 0. 2mmo l / L UNG 酶 5U / L 0. 075U / L T a q 酶 5U / L 0. 05U / L 上 游 引 物( F ) 10 mo l / L 见 附 录 B 下 游 引 物( R ) 10 mo l / L 见 附 录 B 探 针( P ) 10 mo l / L 见 附 录 B DNA 模 板 5 L 超 纯 水 补 足 至 25 L 注: 建 议 选 用 商 品 化 TaqM

24、an 实 时 荧 光 PCR 预 混 液。 9. 3 反 应 参 数 反 应 参 数 为: 502mi n ; 预 变 性 9510mi n ; 9515s , 601mi n , 40 个 循 环。 注: 不 同 型 号 仪 器 的 使 用 可 参 考 仪 器 使 用 操 作 说 明。 9. 4 仪 器 检 测 通 道 的 选 择 设 置 PCR 反 应 管 的 荧 光 信 号 收 集 条 件, 应 与 探 针 标 记 的 报 告 基 团 一 致。 具 体 设 置 方 式 因 仪 器 而 异, 可 参 照 仪 器 使 用 操 作 说 明。 1 0 质 量 控 制 1 0. 1 空 白 对 照

25、: 无 特 异 性 扩 增 荧 光 增 幅 现 象, Ct 值 大 于 等 于 40 。 1 0. 2 阴 性 对 照: 无 特 异 性 扩 增 荧 光 增 幅 现 象, Ct 值 大 于 等 于 40 。 1 0. 3 阳 性 对 照: 内 源 基 因 Ct 值 小 于 或 等 于 30 , 外 源 基 因 Ct 值 小 于 或 等 于 36 。 1 1 检 测 结 果 判 定 和 表 述 1 1. 1 试 样 内 源 基 因 Ct 值 小 于 或 等 于 36 , 外 源 基 因 Ct 值 小 于 或 等 于 36 , 判 定 检 出 外 源 基 因, 检 测 结 果 表 述 为“ 该 样

26、 品 检 出 基 因”。 1 1. 2 试 样 内 源 基 因 Ct 值 小 于 或 等 于 36 , 外 源 基 因 Ct 值 大 于 或 等 于 40 , 判 定 未 检 出 外 源 基 因, 检 测 结 果 表 述 为“ 该 样 品 未 检 出 基 因”。 1 1. 3 试 样 内 源 基 因 Ct 值 小 于 或 等 于 36 , 外 源 基 因 Ct 值 在 3640 之 间, 应 重 新 进 行 DNA 提 取 和 实 时 荧 光 PCR 。 第 2 次 检 测 内 源 基 因 Ct 值 小 于 或 等 于 36 , 外 源 基 因 Ct 值 小 于 40 , 检 测 结 果 表

27、述 为“ 该 样 4 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准品 检 出 基 因”, 外 源 基 因 Ct 值 大 于 或 等 于 40 , 检 测 结 果 表 述 为“ 该 样 品 未 检 出 基 因”。 1 1. 4 试 样 内 源 基 因 Ct 值 大 于 或 等 于 40 , 表 明 不 能 对 该 样 品 实 施 有 效 的 DNA 提 取 和 实 时 荧 光 PCR 检 测, 检 测 结 果 表 述 为“ 该 样 品 未 能 有 效 提 取 基 因 组 DNA ”。 注: 为 油 料 作 物 物 种 名 称。 1 1. 5 试 样 内 源 基 因 Ct 值

28、 在 3640 之 间, 应 重 新 进 行 DNA 提 取 和 实 时 荧 光 PCR 。 第 2 次 检 测 内 源 基 因 Ct 值 仍 大 于 36 , 表 明 不 能 对 该 样 品 实 施 有 效 的 DNA 提 取 和 实 时 荧 光 PCR 检 测, 检 测 结 果 表 述 为 “ 该 样 品 未 能 有 效 提 取 基 因 组 DNA ”。 注: 为 油 料 作 物 物 种 名 称。 1 2 防 污 染 措 施 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施 按 照 GB / T27403 和 GB / T19495. 2 中 的 规 定 执 行。 1 3 P C R

29、 反 应 检 出 限 各 基 因 片 段 实 时 荧 光 PCR 扩 增 的 最 低 检 出 限( LOD ) 为 0. 01% 。 5 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准附 录 A ( 规 范 性) 食 用 植 物 油 D N A 提 取 试 剂 盒 A. 1 试 剂 盒 组 成 重 鼎 ZD-TG- 39 - 15 食 用 植 物 油 DNA 提 取 试 剂 盒 包 括: a ) max i 吸 附 柱: 15 个; b ) 微 量 离 心 柱: 15 个; c ) 50mL 离 心 管: 15 个; d ) 1. 5mL 离 心 管: 50 个; e )

30、DNA 结 合 液: 1. 2mL / 管 3 管; f ) 工 具 酶 A : 400 L / 管 1 管; g ) 溶 液 UT : 12mL / 瓶 1 瓶; h ) 溶 液 AC : 1. 0mL / 管 1 管; i ) 溶 液 BJ : 1. 2mL / 管 3 管; j ) 溶 液 W2 : 2. 0mL / 瓶 1 瓶; k ) 溶 液 TE : 1. 0mL / 管 1 管。 A. 2 试 剂 盒 保 存 条 件 溶 液 AC 长 期 保 存 贮 在 28 。 工 具 酶 A 长 期 保 存 应 分 装 成 小 份 后 贮 在 -20 , 从 -20 取 出 的 工 具 酶

31、A 使 用 期 间 短 期 保 存 贮 在 28 , 不 得 反 复 冻 融。 其 他 组 分 室 温 避 光 保 存。 6 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准7 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准8 S N / T 5 4 0 6 2 0 2 1 以正式出版文本为准1 2 0 2 6 0 4 5 T / N S 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 进 口 食 用 植 物 油 中 转 基 因 成 分 检 测 方 法 SN / T5406 2021 * 中 国 海 关 出 版 社 有 限 公 司 出 版 发 行 北 京 市 朝 阳 区 东 四 环 南 路 甲 1 号( 100023 ) 编 辑 部:( 010 ) 65194242 - 7509 网 址 www. cus t omskb. c om / book 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷 * 开 本 88012301 / 16 印 张 字 数 千 字 2021 年 月 第 一 版 2021 年 月 第 一 次 印 刷 印 数 1 * 书 号: 155175 760 定 价 . 0 0 元 以正式出版文本为准