DB50 T 1044-2020 无菌（Germ-freeGF）猪微生物学监测技术规范.pdf

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1、ICS 65.020.30B40/49 DB50重 庆 市 地 方 标 准DB 50/T 10442020无 菌 （ Germ-free,GF） 猪 微 生 物 学 监 测 技 术规 范 Technical Specification for Microbiological Monitoring of Germ-free Pig 2020-10-10 发 布 2020-12-30 实 施重 庆 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB50/T 10442020 1 目 次前 言 .21 范 围 .32 规 范 性 引 用 文 件 .33 术 语 和 定 义 .34 妊 娠 母 猪 微 生

2、物 学 监 测 .45 无 菌 猪 微 生 物 学 监 测 .46 饮 水 和 日 粮 微 生 物 学 监 测 .67 隔 离 器 和 物 品 微 生 物 学 监 测 .7 DB50/T 10442020 2 前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1-2009给 出 的 规 则 编 写 。本 标 准 由 重 庆 市 畜 牧 科 学 院 提 出 。本 标 准 由 重 庆 市 农 业 农 村 委 员 会 归 口 。本 标 准 主 要 起 草 单 位 ： 重 庆 市 畜 牧 科 学 院 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 葛 良 鹏 、 孙 静 、 梁 浩 、 刘 作 华 、 丁 玉 春 、 吴

3、 梦 、 黄 勇 。 DB50/T 10442020 3 无 菌 （ Germ-free, GF） 猪 微 生 物 学 监 测 技 术 规 范1 范 围本 标 准 规 定 了 无 菌 猪 生 产 及 使 用 过 程 中 的 妊 娠 母 猪 、 无 菌 猪 、 饮 水 和 日 粮 、 隔 离 器 和 物 品 等 微 生 物学 监 测 技 术 要 求 。本 标 准 适 用 于 无 菌 猪 生 产 和 使 用 时 微 生 物 学 质 量 控 制 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅

4、所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB 16551 猪 瘟 检 疫 技 术 规 范GB/T 18090-2008 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 诊 断 方 法GB/T 18448.1-2001 实 验 动 物 体 外 寄 生 虫 检 测 方 法GB/T 18448.2-2008 实 验 动 物 弓 形 虫 检 测 方 法GB/T 18641 伪 狂 犬 病 诊 断 技 术GB/T 18935-2003 口 蹄 疫 诊 断 技 术GB/T

5、21674-2008 猪 圆 环 病 毒 聚 合 酶 链 反 应 试 验 方 法SN/T 1559-2010非 洲 猪 瘟 检 疫 技 术 规 范SN/T 1919-2016 猪 细 小 病 毒 病 检 疫 技 术 规 范NY/T 544-2015 猪 流 行 性 腹 泻 诊 断 技 术NY/T 548-2015 猪 传 染 性 胃 肠 炎 诊 断 技 术NY/T 678 猪 伪 狂 犬 病 免 疫 酶 试 验 方 法NY/T 679 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 症 免 疫 酶 试 验 方 法 3 术 语 和 定 义下 列 术 语 与 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 无 菌 猪

6、Germ-free (GF) pig利 用 现 有 检 测 手 段 ， 无 可 检 出 一 切 活 的 微 生 物 （ 包 括 细 菌 、 病 毒 ） 和 寄 生 虫 ， 能 保 证 猪 源 性 细 胞 、组 织 、 器 官 研 究 的 生 物 安 全 性 和 清 晰 的 微 生 物 背 景 的 实 验 用 猪 ， 简 称 无 菌 猪 。3.2 悉 生 猪 Gnotobitoic (GN) pig以 无 菌 猪 为 对 象 ， 通 过 微 生 物 移 植 技 术 构 建 出 只 含 有 特 定 菌 群 ， 并 始 终 在 可 屏 蔽 外 界 微 生 物 条 件 下 生 活 的 实 验 用 猪

7、， 可 分 为 单 一 菌 株 移 植 悉 生 猪 和 组 合 菌 群 移 植 悉 生 猪 。 DB50/T 10442020 4 3.3 隔 离 环 境 Isolation environment与 外 界 完 全 隔 离 ， 可 阻 断 任 何 外 源 微 生 物 侵 入 的 封 闭 空 间 。3.4 屏 障 环 境 Barrier environment屏 障 环 境 应 作 为 隔 离 环 境 的 第 一 层 保 障 ， 用 于 放 置 和 使 用 无 菌 隔 离 器 。4 妊 娠 母 猪 微 生 物 学 监 测妊 娠 猪 应 未 注 射 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 弱 毒 疫

8、 苗 ， 外 观 健 康 、 无 异 常 ； 应 排 除 经 胎 盘 垂 直 传 播 的 四 种 疾 病 ， 包 括 猪 瘟 、 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 、 猪 伪 狂 犬 病 、 猪 细 小 病 毒 病 。 病 原 筛 查 方 法 参 照 GB/T16551、GB/T18641、 NY/T679和 SN/T 1919-2016 执 行 。5 无 菌 猪 微 生 物 学 监 测5.1 采 样5.1.1 采 样 管 的 准 备宜 采 用 螺 帽 盖 的 采 样 管 ， 内 部 自 带 1支 拭 子 。 也 可 通 过 带 螺 帽 盖 的 离 心 管 和 1 支 棉 签 自 制 而 成

9、 。 采样 管 选 择 在 保 质 期 内 的 、 且 包 装 完 好 的 无 菌 采 样 管 （ 宜 经 过 环 氧 乙 烷 灭 菌 处 理 ） ， 或 提 前 高 温 高 压 灭 菌处 理 。 采 样 当 天 ， 无 菌 采 样 管 放 入 屏 障 设 施 的 传 递 窗 内 ， 并 紫 外 光 照 30min及 以 上 。5.1.2 采 样 管 转 入 隔 离 器 在 保 持 无 菌 猪 饲 养 隔 离 器 传 递 通 道 内 部 密 封 罩 密 封 状 态 下 ， 取 下 传 递 通 道 外 侧 密 封 罩 ， 将 无 菌 采 样管 放 入 传 递 通 道 ， 密 封 外 侧 密 封

10、罩 。 采 用 1.5%-2%新 制 的 过 氧 乙 酸 从 传 递 通 道 外 侧 密 封 罩 上 的 消 毒 孔 ，对 传 递 通 道 内 部 空 间 进 行 喷 雾 消 毒 。 喷 雾 时 间 不 宜 低 于 5min。 密 封 消 毒 孔 ， 并 等 待 30min 以 上 。 通 过无 菌 猪 饲 养 隔 离 器 操 作 手 套 ， 从 隔 离 器 内 部 取 下 传 递 通 道 内 侧 密 封 罩 ， 将 无 菌 采 样 管 移 入 隔 离 器 内 ， 重新 罩 上 传 递 通 道 的 内 侧 密 封 罩 。5.1.3 采 样 过 程根 据 实 验 要 求 用 拭 子 采 集 样

11、本 （ 如 猪 肛 门 拭 子 、 鼻 拭 子 或 新 鲜 粪 便 ） ， 立 即 装 回 采 样 管 ， 并 盖 紧 螺帽 盖 。5.1.4 采 样 管 转 出 隔 离 器取 下 传 递 通 道 内 部 密 封 罩 ， 将 采 样 管 转 到 隔 离 器 的 传 递 通 道 内 部 ， 罩 好 内 部 密 封 罩 ， 再 打 开 隔 离 器传 递 通 道 的 外 部 密 封 罩 ， 将 采 样 管 取 出 ， 重 新 罩 上 外 部 密 封 罩 。 采 用 1.5%-2%新 制 的 过 氧 乙 酸 从 传 递 通 道 外 部 密 封 罩 上 的 消 毒 孔 ， 对 传 递 通 道 内 部 空

12、 间 进 行 喷 雾 。 喷 雾 时 间 宜 不 少 于 5min。5.2 细 菌 监 测 DB50/T 10442020 5 5.2.1 培 养 及 观 察将 采 集 的 样 本 分 别 接 种 于 血 琼 脂 培 养 基 、 脑 心 浸 液 肉 汤 和 硫 乙 醇 酸 盐 培 养 基 ， 分 别 在 需 氧 和 厌 氧 条件 下 37 培 养 48h 及 以 上 。 无 菌 条 件 下 ， 取 培 养 后 的 样 本 ， 涂 片 、 固 定 、 革 兰 染 色 后 显 微 镜 下 检 查 菌体 及 形 态 。 每 个 隔 离 器 ， 宜 平 行 检 测 重 复 3 次 。5.2.2 判 定

13、 标 准固 体 培 养 基 上 ， 应 无 任 何 可 见 菌 落 ； 液 体 培 养 基 内 ， 应 无 浑 浊 、 无 沉 淀 ， 且 镜 检 无 细 菌 菌 体 。5.2.3 监 测 频 率宜 每 周 检 测 1 次 。5.3 真 菌 监 测 5.3.1 培 养 及 观 察将 采 集 的 样 本 接 种 于 大 豆 酪 蛋 白 固 体 培 养 基 ， 分 别 在 20 、 28 和 37 下 需 氧 培 养 48h 及 以 上 。每 个 隔 离 器 ， 宜 平 行 检 测 重 复 3 次 。5.3.2 判 定 标 准固 体 培 养 基 上 ， 应 无 任 何 可 见 菌 落 ， 且 镜

14、检 无 真 菌 菌 体 。5.3.3 监 测 频 率宜 每 周 检 测 1 次 。5.4 无 菌 猪 病 毒 监 测5.4.1 监 测 指 标 应 对 4 种 垂 直 传 播 病 毒 进 行 监 测 ， 包 括 猪 瘟 病 毒 、 细 小 病 毒 、 猪 伪 狂 犬 病 病 毒 、 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合征 病 毒 。 应 对 5种 猪 常 见 病 毒 进 行 监 测 ， 包 括 口 蹄 疫 病 毒 O、 猪 圆 环 -2 型 病 毒 、 猪 流 行 性 腹 泻 病 毒 、 猪传 染 性 胃 肠 炎 病 毒 、 非 洲 猪 瘟 病 毒 。5.4.2 指 标 检 测 标 准无 菌 猪 的

15、 9 种 病 毒 指 标 及 其 检 测 标 准 见 表 1。表 1 9 种 病 毒 指 标 及 检 测 标 准病 毒 指 标 检 测 标 准猪 瘟 病 毒 GB/T 16551-2008 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 按 照 GB/T 18090-2008猪 细 小 病 病 毒 SN/T 1919-2016 DB50/T 10442020 6 猪 伪 狂 犬 病 病 毒 NY/T 678-2003猪 圆 环 -2型 病 毒 GB/T 21674-2008猪 口 蹄 疫 病 毒 O GB/T 18935-2003猪 流 行 性 腹 泻 病 毒 NY/T 544-2015猪 传 染

16、 性 胃 肠 炎 病 毒 NY/T 548-2015非 洲 猪 瘟 病 毒 SN/T 1559-2010 5.4.3 判 定 标 准上 述 9 种 病 毒 不 应 检 出 。5.4.4 监 测 频 率宜 每 月 检 测 1 次 。5.5 无 菌 猪 寄 生 虫 监 测5.5.1 监 测 指 标对 猪 弓 形 虫 、 猪 血 虱 、 猪 疥 螨 3 种 猪 寄 生 虫 指 标 进 行 监 测 。5.5.2 指 标 检 测 方 法 猪 弓 形 虫 检 测 按 照 GB/T 18448.2-2001 执 行 ， 猪 血 虱 、 猪 疥 螨 按 照 GB/T 18448.1-2001 执 行 。5.5

17、.3 判 定 标 准不 应 检 出 任 何 寄 生 虫 。5.5.4 监 测 频 率宜 每 周 检 测 1 次 。6 饮 水 和 日 粮 微 生 物 学 监 测6.1 饮 水 微 生 物 学 监 测 6.1.1 采 样 与 培 养无 菌 条 件 下 ， 取 冷 却 的 灭 菌 纯 水 1mL， 接 种 到 大 豆 酪 蛋 白 固 体 培 养 基 ， 分 别 在 28 和 37 需 氧 培养 24h。 宜 平 行 检 测 重 复 3 次 。 DB50/T 10442020 7 6.1.2 判 定 标 准不 应 检 出 任 何 细 菌 。6.2 日 粮 微 生 物 学 监 测6.2.1 采 样 与

18、 培 养按 照 日 粮 总 量 的 5%进 行 抽 样 检 查 。 无 菌 条 件 下 ， 每 袋 无 菌 猪 日 粮 取 25g， 加 入 25mL灭 菌 水 ， 充 分混 匀 ， 静 置 10min。 取 上 清 液 1mL， 分 别 接 种 到 大 豆 酪 蛋 白 固 体 培 养 基 、 脑 心 浸 液 肉 汤 和 硫 乙 醇 酸 盐 培养 基 ， 在 分 别 在 需 氧 和 厌 氧 条 件 下 37 培 养 72h及 以 上 。 无 菌 条 件 下 ， 取 培 养 后 的 样 本 ， 涂 片 、 固 定 、革 兰 染 色 后 镜 检 。 宜 平 行 检 测 重 复 3 次 。6.2.2

19、 判 定 标 准 不 应 检 出 任 何 细 菌 。7 隔 离 器 和 物 品 的 微 生 物 学 监 测7.1 隔 离 器 的 微 生 物 学 监 测7.1.1隔 离 器 检 测 前 的 准 备隔 离 器 的 准 备 按 照 CQDB2018-0005要 求 进 行 。 准 备 完 成 后 并 运 行 24h以 上 ， 利 用 无 菌 拭 子 对 隔 离 器内 部 表 面 擦 拭 采 样 ， 装 管 密 封 后 无 菌 传 出 。7.1.2培 养超 净 工 作 台 内 ， 将 采 样 拭 子 分 别 接 种 到 大 豆 酪 蛋 白 固 体 培 养 基 、 脑 心 浸 液 肉 汤 和 硫 乙

20、醇 酸 盐 培 养 基 ， 分 别 在 需 氧 条 件 下 28 和 37 培 养 72h 及 以 上 。 无 菌 条 件 下 ， 取 培 养 后 的 样 本 ， 涂 片 、 固 定 、 革 兰 染色 后 镜 检 菌 体 。7.1.3判 定 标 准不 应 检 出 任 何 细 菌 。7.2 隔 离 器 内 物 品 的 微 生 物 学 监 测7.2.1 采 样 与 培 养对 传 入 的 物 品 表 面 充 分 擦 拭 采 样 并 装 管 ， 传 出 隔 离 器 。 超 净 工 作 台 内 ， 将 采 样 拭 子 分 别 接 种 到 大 豆酪 蛋 白 固 体 培 养 基 、 脑 心 浸 液 肉 汤 和 硫 乙 醇 酸 盐 培 养 基 ， 在 分 别 在 需 氧 条 件 下 28 和 37 培 养 72h 及以 上 。 无 菌 条 件 下 ， 取 培 养 后 的 样 本 ， 涂 片 、 固 定 、 革 兰 染 色 后 镜 检 。 7.2.2 判 定 标 准不 应 检 出 任 何 细 菌 。 _