DB11 T 1461.5-2018 实验动物 繁育与遗传监测 第5部分：实验用长爪沙鼠.pdf

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1、ICS 65.020.30 B 44 备案号：60724-2018 DB11 北京市地方标准 DB 11/T 1461.52018 实验动物 繁育与遗传监测 第5部分:实验用长爪沙鼠 Laboratory animal Breeding and genetic control Part 5: Experimental Mongolian gerbil 2018 09 29发布 2019 01 01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 1461.52018 I 目 次 前 言 . I 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语定义 . 1 4 遗传分类及命名 . 1 5 实

2、验用长爪沙鼠的繁育方法 . 2 6 实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量监测 . 2 附 录 A （规范性附录） 封闭群实验用长爪沙鼠微卫星DNA标记遗传检测方法 . 4 DB11/T 1461.52018 II 前 言 DB11/T 1461实验动物 繁育与遗传监测拟分为以下部分： 第1部分：实验用猪； 第2部分：实验用牛； 第3部分：实验用羊； 第4部分：实验用狨猴； 第5部分：实验用长爪沙鼠； 本部分为DB11/T 1461的第5部分。 本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本部分由北京市科学技术委员会提出并归口。 本部分由北京市科学技术委员会组织实施。 本部分起草单位：首都医科

3、大学、中国食品药品检定研究院、浙江省医学科学院。 本部分主要起草人：陈振文、杜小燕、李长龙、岳秉飞、贺争鸣、萨晓婴、巩薇、郭红刚。 DB11/T 1461.52018 1 实验动物 繁育与遗传监测 第5部分：实验用长爪沙鼠 1 范围 本部分规定了实验用长爪沙鼠的繁育和繁殖种群的遗传监测。 本部分适用于实验用长爪沙鼠的繁育和遗传监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 14923 实验动物 哺乳类实验动物的遗传质量控制 3 术语定义 下列术语和

4、定义适用于本文件。 3.1 实验用长爪沙鼠 experimental Mongolian gerbil 经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研 究、教学、生产和检定以及其他科学实验的长爪沙鼠。 3.2 封闭群 closed colony 以非近亲交配方式进行繁殖生产的实验用长爪沙鼠种群，在不从外部引入新个体的条件下，至少连 续繁殖4代以上称为封闭群，亦称远交群。 4 遗传分类及命名 4.1 遗传分类 根据遗传结构特点，实验用长爪沙鼠为封闭群。 4.2 命名 4.2.1 封闭群命名 封闭群命名由由24个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩

5、写名称，第一个字母应 大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。 示例： Cmu：CMU 表示由首都医科大学（Cmu）保持的CMU实验用长爪沙鼠封闭群。 Z：ZLAC表示由浙江省医学科学院（Z）保持的ZLAC实验用长爪沙鼠封闭群。 DB11/T 1461.52018 2 5 实验用长爪沙鼠的繁育方法 5.1 原则 封闭群实验用长爪沙鼠繁殖方法应以保持封闭群动物的遗传概貌和生理特征，避免近交繁殖为原 则。 5.2 引种 繁殖用实验用长爪沙鼠应遗传背景明确或来源清楚，有较完整的资料（包括种群名称、来源、遗传 基因特点及主要生物学特性等）。 保持封闭群实验用长爪沙鼠的

6、遗传异质性及基因多态性，引种动物数量要足够多。为控制引种数量， 可以根据后代繁殖方式，在保证每代近交系数增量不大于1%的前提下，决定引种群规模，引种数目参照 GB 14923执行。实验用长爪沙鼠最小引种群规模为25对，种用动物应三代以内无共同亲代。 5.3 繁殖 保持封闭群实验用长爪沙鼠遗传基因的稳定，种群应足够大，并尽量避免近亲交配。 具体繁殖方法参照GB 14923执行。 6 实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量监测 6.1 实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量要求 封闭群实验用长爪沙鼠应符合以下要求： a) 具有明确的遗传背景资料或来源清楚，有完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及 主要生物

7、学特性等）；并能充分表明新培育的或引种的封闭群实验用长爪沙鼠符合封闭群定义 的规定； b) 用于封闭群保种及生产的繁殖记录应清楚完整，繁殖方法科学合理； c) 经遗传检测（微卫星DNA检测方法等）质量合格。 6.2 实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量检测方法及实施 6.2.1 检测方法 采用微卫星DNA标记检测方法进行，具体方法见附录A。 6.2.2 抽样 随机取实验用长爪沙鼠的血液或其他组织，按表1要求从每个封闭群中随机抽取非同窝成年实验用 长爪沙鼠，雌雄各半。采样数量按表1进行。 DB11/T 1461.52018 3 表1 封闭群实验用长爪沙鼠遗传检测采样数量 单位为只 群体大小 抽样数量

8、少于100 应不少于15 不少于100 应不少于30 6.2.3 群体评价 群体内遗传变异采用平均杂合度或群体平衡状态方法进行评价，按附录A中A.6执行。 6.2.4 检测频率 封闭群实验用长爪沙鼠群体12个月至少进行一次遗传质量检测。 A DB11/T 1461.52018 4 附 录 A （规范性附录） 封闭群实验用长爪沙鼠微卫星DNA标记遗传检测方法 A.1 仪器设备 遗传分析仪，4、-20冰箱，低温高速离心机，水浴锅，感量为0.0001 g的分析天平，pH计，紫 外分光光度仪。 A.2 基因组DNA的提取 用酚-氯仿萃取法或试剂盒提取基因组DNA。 A.3 微卫星位点 用于检测实验用长

9、爪沙鼠遗传质量的微卫星位点为28个，各微卫星位点的名称、引物序列、等位基 因数、PCR反应的Tm值见表A.1。 A.4 PCR扩增 A.4.1 PCR扩增的体系 PCR总反应体积为15 L,其中含10PCR buffer:1.5 L，上下游引物(100 pmol/L) 各1 L ,4dNTP 100mol/L:1 L ,Taq 酶1 U:1 L ,50 ng100 ng 基因组DNA:1 L ，纯水(ddH2O) :8.5 L。PCR反应程序为：95 预变性，4 min；94 变性，30 s；退火温度（各位点序列、PCR反应条 件参见表A.1），30 s；72延伸，30 s；35个循环；72继

10、续延伸7 min；扩增产物4 保存。 A.4.2 PCR产物的凝胶检测 PCR产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。 A.4.3 扩增产物的STR扫描 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩增出目的片断后，选择分别以FAM、HEX、TAMRA标记的三 个位点的扩增产物，以1：3：5体积比混合，取1 L上样进行STR扫描。 A.5 STR扫描结果的判读与统计分析 A.5.1 STR扫描结果的判读 扫描结果可出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波；另一种为杂合基因型，有两个主波。 由群体遗传分析软件读出每个样本在每个微卫星位点的扩增片断大小。每个位点的等位基因根据扩

11、 增片断从小到大顺序排列记录为a,b,c,d等。 A.5.2 运用群体遗传分析软件对数据进行统计分析 DB11/T 1461.52018 5 将所有样本的每个微卫星位点的基因型以ab,bb等形式运用软件的数据文件，计算样品在各微卫 星位点上的基因频率、平均观察等位基因数、平均有效等位基因数（Ne）、香隆指数、平均杂合度（H） 等。 A.6 结果判定 群体内遗传变异采用平均杂合度或群体平衡状态方法进行评价。 当用杂合度来判定时,当平均杂合度在0.50.7时，群体为合格的封闭群群体。当用群体是否达到 平衡状态来判定时，按照哈代-温伯格（Hardy-Weiberg）定律，根据各位点的等位基因数计算封

12、闭群的 基因频率，进行卡方（chi-square test）检验。如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因 型频率发生变化，该封闭群群体判为不合格。 A.7 结果报告 根据判定结果对封闭群实验用长爪沙鼠群体出具遗传质量检测报告。 表A.1 实验用长爪沙鼠微卫星位点的引物序列、最佳扩增温度、等位基因数及等位基因分布范围 位点 引物序列（5-3） Mg2+浓度（mM） 退火温度（C） 等位基因数 等位基因分布范围 AF200942 CAGGCACCCCCAGTTT GTCTACACAGGCTGAGGATGT 2.0 54 15 180-215 AF200943 GGCTCCTGATTCTAC

13、ATTTCT CAACCATTGGCAACTCTC 2.0 57 17 154-181 AF200944 GCTGGGCTTTAATGTTTATTT GGTGGCTCACACTTTCTGT 2.0 54 19 113-134 AF200946 TTTCTGGGGTCTCTTTCTCTC CCATTCTGCAAGACTCCTCT 2.0 57 28 195-242 AF200945 AGTCCCTATTACATCCACAAG TTATCCTGCAAAGCCTAAG 2.0 57 12 166-186 AF200941 TGGGTCCTTTGGAAGA TGGCTTAAAATGAATCACTTA

14、2.0 55 24 115-153 AF200947 GACAGAGTGGGAGGGGTATGT TGGCAAGTTTGGTTTGTTTGA 2.0 55 17 188-212 D16Mit7 CTGCCACCCCTGAACCATTA CTACAAGATGTGGGGCATGA 2.0 52.6 15 480-529 D16Mit26 CAGGAATAAAGTATAATGGGGTGC CCCATGATCAGTTGGGTTTT 2.0 49.1 9 207-266 D1Mit362 TGTGTGACTGCTTGGAAGATG CTGAGTCCCTAAAGTTGTCCTTG 1.5 50.0 16

15、476-504 D8Mit184 GTTTTTCTCAGAAGAATGCAATATACC TGAGAAGAATGAGGAATTTGTCC 2.0 48.1 11 196-229 DB11/T 1461.52018 6 表A.1 实验用长爪沙鼠微卫星位点的引物序列、最佳扩增温度、等位基因数及等位基因分布范围（续） 位点 引物序列（5-3） Mg2+浓度（mM） 退火温度 （C） 等位基因数 等位基因分布 范围 D7Mit33 TCTGAAGTTTGAATGGTTGTGG TTTCAAAATCGTGTCATTTTGC 2.0 47.3 15 376-394 D6Mit37 AAAGAATTGCAC

16、ATCCACTGG TGCCCAGGATGTTTAAGAGG 2.0 47.0 14 246-265 D5Mit31 TCAGGGCTCTCTAAGGGACA ACTATGCAGCCACCAAATCC 2.0 53.1 9 318-350 D12Mit201 CCACTGGATGGCAACAGAC TATGTGTTTCAAAACCACACTCG 2.0 53.1 18 245-283 D2Mit22 GCTCCCTTTCCTCTTGAACC GGGCCCTTATTCTATCTCCC 2.0 49.1 9 173-192 D15Mit124 AGGAGAGAACCAACTGCTGC GGCCAG

17、TGATGACTTTATAATGC 2.5 59.8 17 232-258 D11Mit36 CCAGAACTTTTGCTGCTTCC GTGAGCCCTAGGTCCAGTGA 2.0 58.7 15 234-256 D7Mit71 CCACCTGGAATACATGTAACCC TAAGATCCAAGAGATGGGTTAAGC 2.0 49.1 11 165-200 D2Mit76 CTCAAGTCTCACTTCTCTGCACA ACACCCAAGGTTGACCTCTG 2.0 47.3 19 281-328 D3Mit130 AACACATGAAACGTGTGCGT TGATAGGCATGC

18、TTAAGCCC 2.0 50.6 11 213-251 D19Mit1 AATCCTTGTTCACTCTATCAAGGC CATGAAGAGTCCAGTAGAAACCTC 2.0 49.1 15 133-165 D11Mit35 AGTAACATGGAACATCGACGG TGCTCAGCTCTGGAGTGCTA 2.0 48.1 13 287-307 D17Mit38 CCTCTGAGGAGTAACCAAGCC CACAGAGTTCTACCTCCAACCC 2.0 52.6 14 195-251 DXMit17 CCTGTTTGGGCACCTAGATT TAATAACCCATGTTTTCTGTGGG 2.0 48.1 9 234-251 D8Mit56 ACACTCAGAGACCATGAGTACACC GAGTTCACTACCCACAAGTCTCC 2.0 50.6 9 100-126 D10Mit66 TCTCCTTGGAATTCACAGCC GACATTCCTTAAGAGAGACAGTCC 2.0 54.7 14 272-298 D13Mit1 TCATTCAACATTCTGTCAATCG CACAACAAGGTTAACCTCTAGACA 2.0 49.0 14 104-132 _