第四章：氧的供需与传递.ppt

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1、第四章：氧的供需与传递,好氧微生物在新陈代谢过程中（基质的氧化、菌体的生长、产物的形成）需要氧气，而氧气本身是难溶性的气体，在培养过程中不能向其它的可溶性营养物质一样，一次供应就满足要求，而只能维持很短的时间（15-20 s）。因此，在生产过程中必须不断地向培养基中提供足够的氧,实验室：摇瓶。 中间生产规模/生产规模：通风+搅拌。,提供微生物生长和代谢所需的氧，并提高营养物质和代谢物质的传递速度。,0.045 g/L,氧的浓度是其它营养物质浓度的10-3以下,4.1 微生物对氧的需求的量,受菌种的影响：呼吸强度不同、细胞的组成。,受碳源种类的影响 受产物的影响(当有细胞外产物如青霉素）,Dar

2、lington,1964,酵母成分表示为 C3.92H6.5O1.94,从碳氢化合物和碳水化合物生成酵母的反应可用下式表示： 7.4CH2+6.135O2=C3.92H6.5O1.94+3.22CO2+3.98H2O 6.67CH2O+2.1O2=C3.92H6.5O1.94+2.75CO2+3.42H2O,碳源的性质决定着发酵的需氧量。,Qo2为比耗氧速率/呼吸强度mol/（kg干细胞.s). (Qo2)M 为最大比耗氧速率；X为菌体浓度(kg干细胞/m3);YG: 单位质量的底物生成细胞的得率.YP:单位质量的底物生成产物的得率。耗氧速率 r = Qo2X(mol/m3.s),临界溶氧浓度

3、：当培养基中不存在其它限制性基质时，不影响好氧性微生物繁殖的最低的溶解氧的浓度。一般为饱和浓度的1-25%。 饱和溶氧浓度: 该温度下的氧的溶解度。 氧的饱满度：溶解氧的浓度与临界氧浓度之比。,临界浓度,培养的目的不同，选取不同的供氧条件 获取细胞本身：保持溶解氧的浓度高于临界溶氧浓度。从而满足微生物的最大需氧而得到最高的微生物的细胞产量。 以获得细胞代谢产物为目的，溶氧对代谢产物影响有不同的情况 代谢产物的生成的最佳需氧量与细胞生长的最佳需氧量相同。 采用供养的浓度大于临界溶氧浓度。 代谢产物的生成的最佳需氧量与细胞生长的最佳需氧量高。尽可能的提高供氧浓度。脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸等。

4、 代谢产物的生成的最佳需氧量与细胞生长的最佳需氧量低。使氧的满足度小于1，如苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、头孢霉素的生产。,4.2 培养过程中的传质理论,好氧微生物只能利用溶解态的氧，发酵过程中不断地通过通风和搅拌，使气态中的氧经过一系列的传递步骤到液相。,4.2.1：气液相间的氧传递,从气泡中的气相扩散通过气膜到气液界面； 通过气液界面； 从气液界面扩散通过气泡的液膜到液相主体； 液相溶解氧的传递； 从液相主体扩散通过包围细胞的液膜到大细胞表面； 氧通过细胞壁； 微生物细胞内氧的传递；,通常和步传递阻力最大，是整个过程的控制步骤,描述氧传递的模型有三种：双膜理论、渗透扩散理论和表面更新理论。其中

5、以双膜理论应用最广泛。,当气液传递过程为稳态时,总的传递速率与通过气，液膜和气液界面等串连各步的氧传递速率相等。,Jg=Jl=J kg(p-pi)=kl(Ci-C)=KL(C*-C)=KG(p-p*),描述单相某一组分传质：Fick公式J=-Ddc/dx, 对稳态的片状层，传质流 J=DC/d,而此公式适合于双膜理论的扩散过程。,由双膜理论的（2）可知：pi=HCi,（Henry定律） ,p*=HC, p=HC*,1/ KL = (C*-C)/J=(C*-Ci)/J+(Ci-C)/J 1/ KL =1/(Hkg)+1/kl 同理: 1/ KG =1/kg+H/kl 对于氧气来说，H很大，因此就

6、有1/(Hkg)远远小于1/kl，即1/ KL 1/kl，说明液膜阻力占传质过程阻力的主导地位。由于液相中的C和C*易测定或推算，因此，以（C*-C)为推动力表示的传质通量J普遍。,J=KL(C*-C),J表示的是单位界面上单位时间的传氧量，由于界面面积的大小无法求得，因此常以单位体积中的气液两相中的总界面（a)表示体积传氧速率OTR。 OTR =Ja=KLa(C*-C),式中， OTR为体积传氧速率（kmol/m3), Kla为体积传氧系数(h-1,or s-1)，反映了发酵罐内氧传递能力的一个重要参数。,4.2.2 液固相间的氧传递,当氧的传递达到稳态时，通过细胞或细胞团外液膜的传递速率为

7、OTR=KLCc(CL-CC) 式中： c液固比表面积，m2/m3; CC细胞或细胞团表面氧浓度，mol/m3, CL液相主体氧浓度，mol/m3. 设细胞或细胞团为球形，即有NSh=2+1NReNSc,3,2,NSh为Sherwood 准数， NSh =(KLCdp)/DL NRe为Renolds准数，NRe=(dpL)/L NSc为Schmidt准数, NSc = L /(DLL); 式中dp颗粒直径，m; DL氧在液相中的分子扩散系数，m2/s; 固液相对运动速度，m/s; L 液体黏度，Pa.s; L液体密度,kg/m3; 1、 2、 3 常数。,因为细胞密度和液体密度及其相近， 因而

8、，相对运动速度接近于零，即有NSh=2 NSh =(KLCdp)/DL KLC=2DL/dp 又OTR=KLCc(CL-CC) (OTR)m=KLCcCL =2(DL/dp)n CL; 式中， (OTR)m 最大氧传递速率， mol/m3.s; n 单位体积培养液中细胞个数； 每个细胞的表面积m2,kLa的测定方法,亚硫酸盐氧化法 取样极谱法 物料衡算法 排气法 复膜电极法,溶氧的测定方法,化学法 极谱法 复膜氧电极法 压力法,MnSO4+2NaOH-Mn(OH)2+Na2SO4 2Mn(OH)2+O2-MnO(OH)2 MnO(OH)2+Mn(OH)2-MnMnO3+2H2O MnMnO3+

9、3H2SO4+2KI-2MnSO4+I2+3H2O+K2SO4 I2+2Na2S2O3-2NaI+NaS4O6,受样品颜色和还原性的影响,化学法,一分子的溶氧-一分子的碘-两分子的硫代硫酸钠,溶解氧在一定的条件下，被还原成H2O2 酸性时：O2+2H+2e-H2O2 中性或碱性时：O2+2H2O+2e-H2O2+OH-,在待测样液中，加入一个固定电压（0.8V)，在阴极处发生上述反应，使待测液主体与阴极表面附近的液体存在溶氧浓度差，通过测定电流的大小，求出液体的溶氧浓度。,CL=(iL)/(2FDLA),式中：i;电流(A); F:法拉第常数；A:阴极表面的表面积；CL: 待测液的溶氧浓度（m

10、ol/m3), L: 液膜厚度（m） DL氧在液相中的分子扩散系数，m2/s;.,反映的准确性受溶液的其它氧化还原物质的影响,极谱法,复膜氧电极法,复膜氧电极,金属电极2个 电解质 透气的塑料袋,阴极: Ag/Pt, O2+2H2O 阳极：Pb, Pb,4OH,Pb2+2e,氧从液相主体到阴极表面的推动力是氧分压。 则氧的扩散通量 J=K(PL-PC)I=4FAJ=4FAKPL=KPL,扩散电流和氧浓度之间有一个线性关系.,压力法,恒温密闭容器中,有体积为VL的液体。通入气体压力为P1,体积为VG的气体至平衡时为P2。 即有(P1-P2)VG=n RT n=SVL, S= (P1-P2)VG/

11、RTVL, S: 氧的溶解度（mol/m3); R: 气体常数，T: 绝对温度,亚硫酸盐氧化法,原理：以Cu2+或Mg2+为催化剂，SO32-很快被O2氧化为SO42-,反应速度很快，因此是溶氧速度控制氧化反应。 反应式如下：2Na2SO3+O2 2Na2SO4 (a)Na2SO3+I2+H2O Na2SO4+2HI (b)2Na2S2O3+I2 Na2S4O6+2NaI ,OTR= KLa(C*-C),由于反应进行的很快，C=0, OTR= KLaC*，C*=0.21mmol/L OTR=(V.N)/(1000m.t.4)， N-Na2S2O3的当量浓度，m样液的体积（ml), t两次取样的

12、间隔(min), V滴定通气前后样品时所耗硫代硫酸钠的体积差(ml)。Kla= OTR/0.21,在0.0180.45M的范围内，温度在20-45,(a)式的反应与Na2SO3浓度无关，且大于氧的传递速率,氧传递是整个过程的控制步骤。通过测定Na2SO3的消耗速率，可以求得氧的传递速率。,影响氧传递速率的主要因素,液体的性质对氧的溶解度的影响 液体的比表面积 氧传递系数,液体的性质对氧的溶解度的影响,溶液的温度：氧气的溶解度随温度的升高而降低。CW*=14.6/(t+31.6),溶液中电解质的浓度：单一电解质(CW* / Ce*) =KCE Ce*：氧在电解质溶液中的溶解度（mol/m3) C

13、E：电解质溶液的浓度（kmol/m3); CW*：与空气平衡的水中氧浓度（ mol/m3)； K: Sechenov常数； 多元电解质( CW* / Ce*) =hiIi, Ii=(1/2)ZiCEi; 式中hi: 第I种离子的Sechenov常数，m3/kmol, Ii；离子强度kmol/m3; CEi；第I种离子的浓度,kmol/m3,非电解质溶液中，氧气的溶解度随溶质浓度的升高而降低。(CW* / Cn*) =KCN, Cn*氧在非电解质溶液中的溶解度（mol/m3)；CN：非电解质溶液的浓度（kg/m3);,i,培养基中含有电解质和非电解质，氧的溶解度 (CW* / Cm*) = hi

14、Ii+ (CW* / Cnj*) , 式中Cm*氧在混合溶液中的溶解度（mol/m3),i,j,液体的比表面积,=VG/(/6)dB3 (dB2)/V=6 VG/(dBV), 令H0= VG/V, =6 H0/ dB 气液比表面积与气体的截流率成正比，与气泡的平均直径成反比. 通常，气泡的dB与液体的流体性质（表面张力，密度，黏度）和外部操作条件H0 和搅拌功率PG、发酵液的高度HL,，气泡的上升速度B，通气量QG相关， =6 QG HL / (dB B V),气泡个数,氧传递系数,搅拌：使气泡在液体中产生复杂的运动，延长气体的停 留时间，增大气体的截流率，同时将气泡粉碎，减小气泡 的直径。,

15、空气的线速度：,在一定的范围内，速度的提高会导致氧传递系数的提高。,当超过一定的范围，反而会降低,空气分布管： 与分布管的形式、喷口直径、管口与罐低的相对距离对氧传递系数有影响。,培养液的性质：包括表面张力，密度，黏度，离子浓度，扩散系数等，这些会影响气泡的大小和稳定性和液体的团流性以及界面活膜的阻力。,表面活性剂：,具有亲水端和疏水端的物质，分布在气液界面，增大了传质阻力，使氧的传递系数KLa发生改变(下降）,离子强度：,菌体浓度：,在电解质溶液中生成的气泡比在水中小，因而有较大的比表面积。因而在同样的条件下， 电解质溶液的KLa比水大，并且随着电解质浓度的增加， KLa也有较大的增加。,培

16、养液中的菌体浓度队也有很大的影响。一般地，菌体浓度高， KLa降低。如图所示。,控制溶氧的工艺手段,改变通气速率 （通气量的改变）,在低通气量的条件下，增大通气量对提高Kla效果明显,在通气量已经很大的条件下，再增大通气量，效果不明显，甚至会产生副作用。 如泡沫的生成，水分的蒸发，罐温的升高，以及杂菌感染的几率增加,改变搅拌速度 较明显的增加Kla,通气泡沫被充分粉碎，增加了有效气液接触面积；,使气泡周围的液膜和菌体周围的液膜厚度减小，并延长了气泡在液体中的停留时间,改变气体组成中的氧分压,即改变了空气中的氧浓度，因而提高了C*值，从而提高了供氧能力。该法在动植物培养体系中，已用于短时间提高溶

17、氧。,改变罐压,即改变了氧的分压，因而提高了C*值，从而提高了供氧能力。但效果有限。原因: 增加了空压机的出口压力，导致动力消耗的增加。 相应地增加发酵罐的耐压强度 CO2的溶解度随着压了的增加也随着增加，导致了培养液的pH发生改变，,加入传氧中间介质,改变发酵液的理化性质,菌体的生长和代谢导致发酵液的性质（表面张力、黏度、离子强度）发生改变，因而改变培养液中气泡的大小、稳定性以及液体的流动和界面液膜阻力、导致溶氧的速度发生改变。 若发酵液性质限制了氧传递时，因对某一性质加以修饰，家消泡剂，无菌水等。,传氧中间介质是不溶于培养液的液体，对微生物无毒，本身具有较高溶氧能力的有机体。传氧中间介质有

18、血红蛋白、 烃类碳氢化合物（煤油、石蜡、甲苯与水等）。 含氟碳化物：例如正十二烷，35，105 Pa的氧的溶解度为54.9 mg/L,而在同样的条件下，水中的溶解度为39.2 mg/L.,氧载体加入到培养体系中，作为非连续相，在搅拌的气液体系中被分散成比气泡还小的微滴，它一方面起到表面活性剂的作用，降低表面张力，增大了单位体积液体中气液界面面积；另一方面，在气泡周围的氧载体与气液界面之间形成一层薄膜，增大了通过水膜进入水相的推动力，从而提高了传氧速率。,第五章：生物反应器,利用生物催化剂进行生物技术产品生产的反应装置或是生化反应进行的场所，称为生物反应器。 是实现生物技术产品的关键设备，起到连

19、接原料和产品的桥梁的作用。其大小范围20 L250 m3或更大(如废水处理2700 m3)。,生物反应器的特点 严密的结构，具有避免杂菌或噬菌体感染的能力；尽量减少法兰连接，接管或焊接保持光滑，无死角，所有的阀件和配管部分均可进行蒸汽灭菌，结构简单以清洗和拆除，并能承受一定的压力； 良好的液体混合性能； 较高的传质、传热性能； 配套而又可靠的监测和控制仪表；,5.1 生物反应器的分类,生物反应器的类型,间歇式（分批），连续式和半连续式,理想反应器和非理想反应器,罐式（高径比1-3）；管式（高径比30）；塔式（高径比10）；膜式,均相和非均相（固定床和流化床),生物反应器和酶反应器,微生物细胞反

20、应器。植物细胞反应器和动物细胞反应器,5.2 几种典型的生物反应器,机械搅拌式生物反应器,壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统等,通用型发酵罐的几何尺寸： H0/D=1.7-3 d/D=1/21/3 W/D=1/8-1/12 B/D=0.8-1.0 s/d=1-2.5,Laboratory Process Development Fermentor Experiments,Agitation Cooling and heating Air inlet and outlet pH control Nutrient addition Inoculation Viewin

21、g port,发酵罐的组成。,壳体：体供微生物一个密闭的环境，设计耐压3atm. 控温部分：测温的传感器及冷却和加热用的夹套或盘管 搅拌部分：为了物料的混合和打碎气泡。 通气部分：从罐低通入无菌空气，入口空气1-2atm,顶部有空气的出口。 进出口：发酵原料进入及发酵后液体 的泵出。 酸碱出口，调pH 补料口：补充营养物。 测量系统：pH, 溶氧传感器 附属系统：视镜、挡板、,挡板部分：防止搅拌运转时产生的漩涡，为了防止积垢，在挡板与壁之间留有空隙。 全挡板条件：使漩涡基本消失，而增加挡板或其它附件时，搅拌功率不再增加。,无挡板,有挡板,(W/D)m=0.4,当满足以下条件时,有四个宽度为W=

22、(1/8-1/12)D就以满足全挡板条件。,搅拌器对液体产生轴向流动和径向流动。一般旋浆式搅拌器是流体产生轴向运动，故称为轴向流搅拌器。而涡轮式搅拌器成为径向流搅拌器。目前由于后者由于优良的脚板效果，多采用。只采用一个搅拌器的称谓单级，而相应的多级浆用于混合高黏度介质。,a: 螺旋桨；b:圆盘平直叶涡轮浆； c:圆盘弯叶涡轮浆；d:圆盘剪叶涡轮浆,搅拌轴从罐顶伸入或低伸入，后者由于重心低，稳定性好，传动噪音低，但要求严格。,Laboratory process development Lab scale fermentor Experiments,Batch process Fed-batch

23、 process Continuous process Semi-continuous process,Laboratory process development Shake Flask Experiments,Optimization of conditions for cell growth and product formation using shake flask experiments:1. pH2. Temperature3. Dissolved oxygen (DO)4. Substrate choice5. Maximal and optimalsubstrate conc

24、entration6. Others,Process control and monitoring,Process parameters to be monitors,Sugar consumption,pH,Temperature,Fermentation time (h),Agitation,Cell Dry Weight,Product,Computer softwares have been developed to monitor and change the process on line,Fermentor sizes for various purposes,Industria

25、l Fermentation Setting,反应器的搅拌功率,1、牛顿流体中的搅拌功率,搅拌器以一定的速度旋转时，用以克服介质阻力所需用的功率搅拌功率。其大小取决于叶轮的结构、尺寸、转速、流体的物性、挡板的尺寸及数目等。Rushton等人用因次分析法进行了研究，提出在全挡板的条件下，不通气的条件下，搅拌功率与其他因素的关系为,P0不通气时的搅拌功率（W); L-液体密度（kg/m3); -液体黏度（Pa.s);di搅拌器的直径（m);n搅拌器的转速（r/s),功率准数Np: 表示外力与被搅拌液体的惯性力之比；雷诺准数NRe: 表示惯性力与粘性力之比。,K与x：决定于搅拌器的形式，挡板的尺寸及

26、流体的流态。在相似的设备中，不同的搅拌器，随着NRe的变化，在对数坐标描绘的曲线如下图所示,A: 当NRe 10， Np和NRe直线关系。x= -1,表示外力与液体黏度成正比，而与密度无关。P=Kn2di3 B:当NRe 104，液体处于湍流状态，x=0, Np不随Nre变化，搅拌功率与密度成正比而与液体的黏度无关。P=Kn3di5= Np n3di5 Np=6，对于圆盘六平直叶涡轮；Np=4.7，对于圆盘六弯叶涡轮 Np=3.7，对于圆盘六剪叶涡轮。 C: 当10 NRe 104,K与x随Nre变化,搅拌功率计算复杂。,通气培养条件下，搅拌功率的计算。 搅拌功率要小于不通气的。Michael

27、 和Millerzai 3.5-13.5 L,福田秀雄 40m3,其中;Pg、P0通气、不通气时的搅拌功率（Kw) n搅拌器的转速（r/min),di搅拌器的直径（cm), Q通气流率（ml/min),n: r/min, di: cm, Q: ml/min,n:r/s,5,机械搅拌自吸式生物反应器,特点：无空气压缩机。搅拌器是一空心叶轮，其快速的旋转使液体被甩出，而形成负压，将罐外的空气吸入罐内，因而省去了空气系统，并且使气体分布均匀。但由于负压操作，增加了染菌机会，,气升式环流生物反应器,为一种新型的生物反应器，无搅拌器，且有定向的循环流动，有内环流式和外环流式反应器，其反应溶液分布均匀，较

28、高的溶氧速率和溶氧效率，剪切了小，均有良好的产热性能，结构简单，操作和维修方便，特别是用于生产对剪切力敏感的动植物细胞的培养。,上流区：由于形成气液混合物密度降低而向上运动。 下流区：而含气率小的区域由于密度高于上流区的而向下运动， 导流筒：控制液体的主体定向流动,A:外循环气升式发酵罐(将下降管置于反应器外部）。； B&C:内循环气升式 发酵罐。,高位塔式生物反应器,该反应器有较大的高径比，无搅拌器，利用通入液体的空气气泡上升时带动液体的运动，产生混合效果，适合培养液黏度低，含气量少，需氧较低的培养过程。此反应器结构简单，剪切力小，动力消耗少，成本低。,作业：158: 2,5.2 生物反应器

29、的放大,几何相似放大,单位体积液体中搅拌功率相同放大,单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大,以空气线速度相同的原则进行放大,以Kla相同的原则进行放大,几何相似放大,， ，,单位体积液体中搅拌功率相同放大,对于不通气的搅拌反应器，由于,对于通气的搅拌反应器，由于,单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大,表示空气流量大小的两个方法：,式中：D反应器的内径，m; t反应器的温度，；VL发酵液的体积，m3; PL液体平均绝对压力，Pa.,两者的相互关系如下所示,以单位体积培养液空气流量相同的原则进行放大时，有(VVM)2=(VVM)1,以空气线速度相同的原则进行放大,以Kla相同的原则进行

30、放大,，,因为,也有采用以下表达式进行放大,2.1,例：某厂在 100 L的实验罐中进行了利用枯草杆菌发酵生产-淀粉酶的中试，获得了比较好的结果。请利用以下的中试结果将发酵罐放大至20 m3。中试结果：发酵液可认为是牛顿流体，发酵液中悬浮固体的容积与悬浮液总体积之比是0.10，35时测得的滤液黏度是1.5510-3 Pa.s,发酵液的黏度为2.25 10-3 Pa.s，密度为1010 kg/m3, 实验罐的内径D=0.375 m, 搅拌器的直径d=0.125 m, D/d=3, H/D=2.4, HL/D=1.5, 四块垂直挡板W/D=0.1,发酵液装填系数为0.60，通气量为1.0 VVM,

31、 搅拌器装有两只圆盘六弯叶涡轮，转速为350 r/min。,此菌为高耗氧速率的细菌，应采用溶氧系数相等的准则进行放大。而且发酵液为牛顿性流体。,1、先求搅拌雷诺数,=(0.125)2(350/60) 1010/2.25 10-3 =4.09 104,属于湍流,且为圆盘六弯叶涡轮,所以Np为4.7，双涡轮无通气搅拌功率,=4.7 0.1255 (350/60)3 1010 2 =0.0586(Kw),通气搅拌功率,=2.25 10-3(0.05862 350 12.53)/600000 0.080.39 =2.25 10-3(2300/2.41)0.39 =0.033(kw),=(2.36+3.

32、3 2)（0.033/0.060）0.56 54.3 0.7 350 0.7 10-9 =6.38 10-6（mol/ml.min.atm),空气线速度: vg=空气体积流量/罐截面积=(vvm.VL)/( /4) 37.52 =54.3（cm/min),2、按几何相似确定方大罐的主要尺寸 由题意可知：D/d=3, H/D=2.4; HL/D=1.5, 取装填率为0.6 则放大罐的有效容积为20 0.6=12 （m3), ( /4)D2 1.5D=12, D=2.16 (m), d=0.72 (m),3、按Kd相等原则确定放大罐的搅拌功率及转速,前面在实验罐中以求得Kd为=6.38 10-6（mol/ml.min.atm)由因为,其中：放大罐中的VL为12 m3, vg为150 cm/min(经验值）,有根据,联立求解，得放大罐的搅拌速度n=109r/min,P。=11kw, Pg=8.1kw,