DB12 T 647-2016 大白菜品种纯度SSR分子标记检测方法.pdf
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1、 ICS 67.050 B 31 天 津 市 地 方 标 准 DB12 DB12/T 647 2016 大 白菜品种纯度 SSR 分子标记 检测 方法 Methods of identifying varietal purity of Chinese cabbage by using SSR-based markers 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市 市 场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 647 2016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 本标准由 天津市 农村工作 委员会 提出。 本标准起草单位: 天津市农业质量标准
2、与检测技术研究所 、 天津市蔬菜研究中心 。 本标准主要起草人: 赵新、 王超楠、 兰青阔、 王成、刘莉莉、 朱珠、李梅 、 陈锐、 徐石勇 。 本标准 2016 年 9 月首次发布。 DB12/T 647 2016 1 大白菜 品种 纯度 SSR 分子标记 检测 方法 1 范围 本 标准规定了 大白菜 品种 纯度 SSR分子标记 检测 方法的 术语和定义、检测方法 、纯度计算方法 。 本 标准适用于 大白菜 单交种的纯度 检测 。 2 规范性引用文件 下列文 件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改
3、单)适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种 纯度 varieties purity 品种纯度 指种子在 SSR分子标记带型方面典型一致的程度 ,用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示, 以反映 某品种 特征特性 的 一致 性程度。 3.2 聚合酶链式反 应 polymerase chain reaction( PCR) 一种在体外通过酶促反应扩增特异 DNA片段的技术。 3.3 简单重复序列 simple sequence repeat(
4、 SSR) 由几个核苷酸( 1-6个)为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个 bp(一般为 100-200bp)的串联重复序列,又称微卫星序列或短串联重复序列,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 3.4 分子标记 molecular marker 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础,检测生物在遗传上的差异。 4 原理 SSR分布于 大白菜 整个基因组, 每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性,利用 PCR技术将多态的 SSR扩增出来,通过电泳检测扩增产物,利用电泳图谱进行 大白菜 品种 纯度 检测 。 DB12/T 647 2016 2 5 仪器设备及试剂 5.1 仪器设备 PCR
5、仪;测序电泳槽;水平电泳槽;高压电泳仪( 3000 V, 400 mA, 400 W);万分之一电子天平;微量加样器;磁力搅拌器;台式离心机;紫外 -可见成像系统;胶片观察灯;水平摇床;高压灭菌锅; pH计等。 5.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠( EDTA-Na2);三羟甲基氨基甲烷( Tris);盐酸( HCl, 36%);十二烷基硫酸钠( SDS);氯化钠 ( NaCl);氢氧化钠( NaOH);硼酸;去离子甲酰胺;溴酚蓝;二甲苯青FF;甲叉双丙烯酰胺;丙烯酰胺;尿素;亲和硅烷;剥离硅烷;无水乙醇;四甲基乙二胺( TEMED);过硫酸铵;冰醋酸;硝酸银;甲醛溶液( 37%); Taq DNA
6、聚合酶(含 Mg2+的 10 PCR缓冲液);四种脱氧核糖核苷酸( dNTPs); SSR引物;琼脂糖; Gold View染料 ;实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682规定的一级水 等。 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯试剂。 5.3 溶液配制 相关溶液配制方法见附录 A。 6 方法步骤 6.1 取样 按照 GB/T 3543.2规定方法扦样,从送检样品中随机取 10 g种子 , 分别随机取其亲本种子 10粒 。 6.2 单粒种子的 DNA 提取 6.2.1 样品 预处理 在玻璃培养皿底部垫上一层厚度 适宜 的棉花, 用自来水 浸湿后均匀 地 撒上种子,再于 表面覆盖一层 纱布 , 置
7、于 光照培养箱中 。培养条件为 16小时 35 光照 培养 , 8小时 28 暗 培养 , 待 种子长出 子叶 后备用。 也可 采用经验证的、等效的 培养条件 。 6.2.2 DNA 提取 取 单株 幼苗 子叶, 放入 1.5 mL离心管中,在液氮中研碎,放入 1.5 mL离心管中。将 DNA提取液预热到 65 ,每管放入 400 L 混合样品,将离心管置于 65 金属浴或水浴锅中,保温 30 min后取下,向离心管中加入 400 L 24:1氯仿 -异戊醇( V:V),振荡混匀。 10 000 g离心 10 min。将上清液 200 L 转入另一支 1.5 mL离心管,加入 400 L -2
8、0 预冷无水乙醇沉淀 DNA。 10 000 g离心 1 min,弃上清液,加入 500 L 乙醇 乙酸铵溶液, 6000 g离心 5 min收集沉淀。加入 100 L TE( pH8.0)溶液溶解 DNA。 用0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA。使用紫外 -可见成像系统观察 DNA电泳条带的完整性。 6.3 分子标记筛选 用 30对核心引物进行 PCR反应,扩增双亲及送检样品各 10份 DNA,筛选带型清晰,双亲间差异大,互补性好的引物作为纯度 检测 的 SSR分子标记。 6.4 PCR 扩增 DB12/T 647 2016 3 6.4.1 反应体系 总体积 20 L,包括 9.2 L超
9、纯水、 2 L含 Mg2+的 10 PCR缓冲液、 1.6 L dNTPs( 2.5 mmol/L)、3.2 L SSR引物( 10 mol/L)、 2 L Taq DNA聚合酶( 2.5 U/L)、 2 L DNA( 3050 ng/L) ,混匀。 6.4.2 反应程序 94 预变性 5 min; 94 变性 1 min, 58 退火 45 s, 72 延伸 45 s,循环 35次; 72 延伸 7 min;-20 保存 备用 。 6.5 变性 聚丙烯酰氨凝胶电泳 按照附录 C规定的方法,进行 4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶 制作 及 电泳检测扩增产物。 7 纯度计算 以筛选出来的 SSR分子标
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