GB T 18932.8-2002 蜂蜜中红霉素残留量的测定方法 杯碟法.pdf

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1、ICS 67.180.10 X 31 共和l王G/T 18932.8 2002 红-EZ刀国Method for the determination of erythromycin residues in honey一Cylinder plate method 2002-12-30发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2003-06-01实施发布前-E GB/T 18932-2002分为12个部分，本部分为第B部分.GB/T 18932的本部分遵循GB/T20001. 4-2001标准编写规则写规则。本部分的附录A是规范性附录，附录B和附录C是资料性附录.本部分由中华人民共和国国家质量监督

2、检验检疫总局提出.本部分由中华全国供销合作总社归口.本部分起草单位z中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本部分主要起草人g庞国芳、付宝莲、林忠.本部分系首次发布的国家标准.G/T 18932.8-2002 第4部分z化学分析方法的编G/T 18932.8一20022 蜂蜜中红霉残留的测定方法杯瞟法范回GB/T 18932的本部分规定了蜂蜜中红霉素残留量的杯碟测定方法.本部分适用于各种蜂蜜中红霉素残留量的测定.本部分红霉素的方法检出限为0.05mg/kg. 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误

3、的内容或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分.GB/T 6379-1986 (neg IS0 5725 ,1981) 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性GB/T 6682一1992分析实验室用水规格和试验方法(neqIS0 3696 , 1987) 3 原理试样中残留的红霉素经甲醇溶解后，在碱位条件下用三氯甲炕提取，提取液经浓缩并溶解后，利用杯碟法进行检测.并用红霉素标准曲线进行定量.4 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-1992中

4、规定的三级水-4. 1 试剂4. 1. 1 甲院.4. 1.2 正己烧.4. 1. 3 三氯甲烧。4.2 试验菌种枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis).菌种号(ChinaMicrobial Culture Collection)CMCC(Il)63501. 4.3 标准物质红霉素.923 IU/mg或相当者。4.4 工作溶渡的配制4. 4. 1 氢氧化纳溶液，1mol/L。称取40.0g氮氧化俐，溶解于水中并定容至1000 mL. 4.4.2 磷酸氢二纳溶液，10g/L。称取10.0g磷酸氢二钩，辩解于水中并定容至I000 mL. 4.4.3 磷酸盐缓冲溶液，pH8.O.称取16.

5、73 g无水磷酸氢二饵.0.53g无水磷酸二氢饵，溶解于水中并定容至I000 mL. l 一二一一G/T 18932.8-2002 4.4.4 生I现迎盐水.J8.5E/L忖。称取8.5g氯化f纳内.溶自解汗于100o mL水中，121C高压灭菌20min 4.5 标准溶液的配制4. 5. 1 红霉素标准似备;有ft:，准确称取(精确至O.1 mg)适it的红霉素标准物质(4.3)，用甲醇(4.1.)1在解11定容甘、度为1000g/mU按效价换算)的标准储备溶液。4C保存，贮存期限一周.4.5.2 红霉素标准工作部液，JR标准储备浓浓(4.5.1)用磷酸盐绥冲溶液(4.4.3)稀释，配制成浓

6、度为0.05、O.10、0.20、0.40和0.80日/mL的标准工作溶液。当天配制，当天使用。4.6 培养基4. 6. 1 培养基1，见第A.1 :i1号。4.6.2 培养基2:见第A.2章。4.6.3 培养基33见寄A. 3章。4.6.3 培养基3:见附录A中A.3. 4. 7 茵悬液的配制将试验商种(4.2)接种于培养基1内(4.6.1)，经(35士)C培养18h-24h后，再转种于培养基2(4.6.2)的斜面上，置(35土1)C培养7d.镜检芽泡在85%以上后，用10mL生理盐水(4.4.4)洗下菌苔，于65C水泊30min后，离心(3000r/min)20 min，弃去上清液.再加1

7、0mL生理盐水，重复离心步骤两次。最终用10mL生理盐水制成芽抱茵悬液.4C保存，贮存期限一个月.5 5. 1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5. 7 5.8 5.9 仪器均质怒:转速不低于5000 r/min. 离心机z转速不低于4000 r/min. 旋转蒸发器。恒温水浴锅。生化培养箱，(35土1)C。高压灭菌gL培养皿2内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖.牛津杯2不锈钢小管，外径(8.0+0.1)mm，内径(6.0士o.) mm，高度oO.o:J:o.)mm. 游标卡尺g测量范围omm-200 mm，精度士0.02mm. 6 试样的制备与保存6. 1 试样的制

8、备将样品搅拌均匀。分出0.5kg作为试样，和l备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识。6.2 试样的保存将样品于常温下保存，7 测定步骤7. 1 提取利:取10日试tf，精确到O.01 日，置于50mL离心管中，用2X 20 mL甲醇(4.1.1)均质1min (4 000 r/min)后离心20min (4 000 r/min)。合并两次离心的上清液于200mL分液漏斗中。7.2 净化7. 2. 1 甲醇萃取在上述上N液(7. 1)中加入20mL正己皖(4.1.2)充分振荡1min，静置分层，将下层的甲醇相移入另一200mL的分液漏斗中。7.2.2 三氯甲院萃取o -二一一G/T 1893

9、2.8-2002 在上述甲醇相(7.2.1)中加入2mL氢氧化纳溶液(4.4.1)和30mL三氯甲饺(4.1.3)充分振荡1 min，再加入30mL磷酸氢二钊洛液(4.4.幻，振荡1min，静置15min-20min.将三氯甲烧相移人50 mL的容量瓶中，并用三氯甲炕定容至刻度，混匀.EF取其中25mL于150mL鸡心瓶中.在40C水浴的旋转蒸发器上蒸发至干。加入5mL磷M盐缓冲溶液(4.4.3)m解残渣.此熔液含试样量为1. 0 g/mL. 7.3 测定7.3. 1 菌悬液用量的测定在实际测定前，将不同浓度的茵悬液(4.7)加入定量的培养基3(4.6.3)中培养，能使0.05同/mLtR度的

10、红霉素标准工作榕液(4.5.2)产生直径大于10mm、清晰、完整的抑菌图为最适茵悬液用量.7.3.2 检定用平板的制备将从7.3.1测试所得的最适菌悬液用最加入已溶化并冷至55C左右的培养基3(4.6.3)中，充分浪匀并立即倾注在灭茵培养皿中，每平皿加入量为9.0mL.置水平台上凝固后，在每个检定用平板中放置六个牛津杯，使每个牛津杯在半径为2.8cm的困面成60。角间距。所用平板应当天制备.7.3.3 标准曲线的制备红霉素标准工作溶液(4.5. 2) O. 80、0.40、O.20、O.10和O.05g/mL五个浓度中，0.20 Ig/mL标准工作洛液为参考浓度.每个红霉素标准工作浓浓浓度除参

11、考浓度(0.20g/mL)外，各取三个检定用平板为一组，四组共12个检定用平板.每个检定用平板中的三个牛津杯内注满参考浓度(0.20g/mL)标准工作溶液，另三个牛津杯中则分别注满其他浓度的标准工作需液.这样参考浓度(0.20g/mL)标准工作m液将得出36个抑茵图直径读数的数据，其他浓度标准工作m液将各得九个抑茵图直径读数的数据.盖好陶瓦盖，置(35士1)C培养18h士lh后取出，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量各抑茵图直径(精确到0.1mm)，求出各组平板中标准工作溶液浓度及参考浓度(0.20g/mL)抑茵图直径读数的平均值以及参考浓度(0.20g/mL)36个抑茵图直径读数的总

12、平均值.用参考浓度(0.20g/mL)的总平均值减去各组参考浓度(0.20g/mL)的平均值之差为校正值，以此值校正其他各浓度标准工作浓浓以及被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值.将各组校正值代人式(1)和式(2)中，求出L和H值后，在半对数坐标上，以抑菌图直径(mm)为纵坐标(算术级)，以标准工作溶液浓度(g/mL)为横坐标(对数级)，标出L和H点，连一直线，即为标准曲线.L = (3a+2b+c- e) /5 ( 1 ) H = (3e+2d+c-a)/5 . . . . . . . . . (2) 式中zL一一标准曲线上最低浓度(0.05g/mU的抑菌图直径，单位为毫米(mm);H一一标准

13、曲线上最高浓度(0.80g/mU的抑茵图直径，单位为毫米(mm); c一一参考浓度(0.20g/mL)抑茵图直径的总平均值，单位为毫米(mm);a，b、d，e-一一分别表示标准曲线中其他各浓度标准工作溶液(0.05、0.10、0.40、0.80g/mU抑茵图直径数据的校正值，单位为毫米(mm)。7. 3. 4 样品溶液的测定每份样品洛液各用三个检定平板。按7.3. 3标准曲线制备的要求放置牛津杯，各平板中的三个牛津杯中注满参考浓度(0.20g/mL)标准工作溶液，另三个牛津杯中则注满被测样品?在液.将向瓦盖盖好，(35士1)C培养18h:!:lh后，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量抑

14、菌图直径(精确到0.1 mm)，分别求出被测样品溶液及参考浓度抑菌图直径i主数的平均值.3 G/T 18932. 8-2002 7.4 确证试验怕被羽H下品?在i夜抑茵罔直径i主数的平均值二，10mm时，应用薄层色谱法做确证试验，以证明抑菌物确系红霉素。本方法流程图参见附录Bo本方法的添加回收率数据参见附录C。B 结果计算如被测中手品1容i在抑囱图直径读数的平均值10mm，即报告为未检出。如被测样品溶液抑商图直径1主数的平均值;:10mmt按7.3. 3要求校正后，从标准曲线上查出相应的红霉素含量(g/mL)，即得出以g/mL计的红霉素含量，根据确证试验(7.4)报告结果。9 如果样品中红霉素

15、的含量单位用mg/kg表示时，可将g/mL按式(3)进行换算.式中gx= c m x一一样品溶液中红霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); C一一从标准曲线上查出的样品在军液中相应的红霉素含量，单位为微克每毫升(g/mLl; rn一一最终样品溶液中所代表的样品量，单位为克每毫升(g/mL)0 精密度( 3 ) GB/T 18932的本部分精密度数据是按照GB/T6379一1986的规定，通过九个实验室对四个添加水平的试样所做的试验中确定的.获得重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。9. 1 重复性在茧复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(t)，本部分方法的重复

16、性限按方程式(4)计算.蜂蜜中红霉素的含量在0.050 mg/kg-O. 80 0 mg/kg范围s19r = 1. 099 31 19m - 0.578 4 式中zm一一两次测定恒的平均值，单位为毫克每千克(mg/kg)。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定-9.2 再现性( 4 ) 在再现性条件下.获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，本部分方法再现性限按方程式(:;)计算z蜂蜜中红霉素的含量在O.05 0 mg/kg-O. 80 Omg/kg范围R = O. 424 3 m - O. 011 7 ( 5 ) 式中-m一一两次测定值的平均值.单位

17、为毫克每千克(mg/kg)。4 A.1 A.2 A.3 培养基1蛋白陈牛肉膏氯化纳蒸倒水pH 附录A (规范性附录)培养基10.0 g 3.0 g 5.0 g 1 000盯lL7.0士O.1 制作s分装试管，每管约5.0mL. 120C高压灭菌15mino 培养基2膜蛋白陈牛肉膏磷酸氢二何琼脂粉蒸馆水pH 制作:121C高压灭菌20min. 结养基3培养基的成分同A.2，但pH6.5+0.1.制作s分装试管，于121C高压灭菌20mn. 5.0 g 3.0 g 3.0 g 15 g-20 g 1000 mL 7.8-8.0 G/T 18932.8-2002 5 G/T 18932.8-2002

18、 1 mol /L氢氧化铀2mL三缸q:Jti;30mL1o g/L镜IIUI:二制30mL6 L一附录B (资料性附录)方法流程图样品lOg !醉20mL 均M:4000r/min. 1 min 离心4000r Irnin. 20 min 合井上前被E己筑20mL!醇相三姐甲炕相定睿50.L25mL提取擅蓝转嚣盎pH8.0ij露酸盐理冲自被5mL牛T杯(杯理住检恻担告结束E直IX上层弃圭上层弃击一附录C 资料性附录回收率本方法中红霉素添加浓度及回收率的试验数据z在添加最为0.050mg/kg时，平均回收率为101.4%;在添加量为0.200mg/随时，平均回收率为80.7 % ; 在添加量为

19、0.400mg/kg时，平均回收率为87.7%; 在添加量为0.800mg/kg时，平均回收率为90.0%。G/T 18932.8-2002 中华人民共和国国家标准蜂富中红霉素残留量的测定方法杯碟法GB/T 18932.8-2002 4畸中国标准出版社出版北京复兴门外三里向北街16号邮政编码，100045电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售骨开本880X12301/1 6 印张3/4字数15千字2003年3月第一版2003年3月第一次印刷印数1-400盼书号，155066. 1-19300 网址版权专有侵权必究举报电话:(0 10 )68533533