GB T 18448.2-2001 实验动物 弓形虫检测方法.pdf

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1、ICS 65.020. 30 B 44 国v 中华人民共和国国家标准GB/ T 18448. 1 r-y 18448. 10- 2001 实验动物寄生虫学检测方法Laboratory animal- Parasitological examination methods 2001- 08-29发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002- 05-01实施发布GB/ T 18448.2- 2001 前士一口本标准由GB/T14926.34-1994(实验动物弓形体检验方法修订而成。本标准删除了GB/T14926. 34一1994中注意事项的所有内容，增加了检测原理和间接免疫荧光法(IFA)

2、，以及犬、猴等实验动物的弓形虫检测内容。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:屈霞琴、李冠民、诸欣平、潘振业、刘兆铭。本标准于1994年1月首次发布。5 中华人民共和国国家标准GB / T 18448. 2- 2001 实验动物弓形虫检测方法代替GB/T14926. 34- 1994 Laboratory animal- Method for examination of Toxoplasma gondii 1 范围本标准规定了实验动物弓形虫的间接血凝(lHA)法和间接免疫荧光法(lFA)检测方法。本标准适用于小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔

3、、犬及猴等实验动物弓形体的检测。2 材料和试剂2. 1 弓形虫抗原致敏绵羊或人红细胞。2.2 正常对照绵羊红细胞。2. 3 阳性对照血清。2.4 阴性对照血清。2. 5 稀释液:含1%健康兔血清的磷酸盐缓冲液CPBS:1/ 15 mol/L Na2HP04 7. 3 mL; 1/ 15 mol/ L KH042.7 mL;蒸馆水90mL)。2.6 微量血凝试验反应板。2. 7 微量加样器。2.8 元菌试管、股管。2. 9 震荡器和冰箱。2.1 0 荧光显微镜。3 间接血凝法(lHA)3. 1 原理在一定条件下，抗原可致敏绵羊(或人红细胞，致敏红细胞遇相应抗体时，产生凝集反应。3. 2 取样无菌

4、采血约1mLC小鼠、大鼠、地鼠眼部采血;豚鼠心脏采血;兔、犬及猴耳部采血)，斜放待凝，4C冰箱中过夜。3. 3 分离血清无菌条件下将冰箱中过夜后的血样管中的血清轻轻吸到另一无菌试管中。3.4 灭活血清将分离出的血清，置56C恒温水浴中灭活30min。3. 5 IHA试验以稀释液在微量反应板中依次对每份血清进行倍比稀释，每份血清稀释两横排，每孔最后留量为0. 025 mL。设阳性血清、阴性血清、空白对照各一孔。第一横排滴加弓形虫致敏绵羊(或人红细胞0. 025 mL，第二横排滴加正常对照绵羊红细胞0.025mL。然后将加好样品的微量反应板置震荡器上震荡3min.5 min，使抗原抗体(即致敏红细

5、胞与待检的稀释血清充分混合.15C.28C室温下过夜后观中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-08 -29批准2002 - 05 -01实施6 GB/ T 18448. 2- 2001 察结果。3. 6 结果记录3. 6. 1 红细胞呈膜状均匀沉于孔底，中央无沉点或沉点小如针尖，记为+。3.6.2 红细胞虽呈膜状沉着，但颗粒较粗，中央沉点较大，记为+。3.6.3 红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大，记为+。3. 6. 4 红细胞沉集于中心，周围有少量颗粒状沉着物，记为+。3. 6. 5 红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚，记为一。3.6.6 出现+孔的血清最高稀释

6、倍数定为本间接血凝试验的凝集效价。运1: 16为阴性;1 : 32为可凝;注1: 64为阳性。4 间接免瘟荧光法CIFA)4. 1 原理固定在玻片上的虫体含特异性抗原，遇相应抗体后形成抗原抗体复合物，可与相应的第二抗体荧光素结合物结合。在荧光显微镜下可观察到有无荧光及其强弱程度。4. 2 IFA玻片抗原的制备弓形虫RH株腹腔接种小鼠.35d天后处死，收取虫体，膜酶消化，一定浓度涂片，充分晾干后丙酣固定，备用。4. 3 阳性血清自然感染弓形虫的动物抗体阳性血清或弓形虫免疫血清。4.4 阴性血清确证无弓形虫感染的动物血清。4.5 荧光结合物4. 5.1 抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬和猴IgG异

7、硫氧氢酸荧光素结合物用于检查相应实验动物血清抗体。使用时用含1/2000伊文思蓝pH7.2磷酸盐缓冲液CPBS)稀释至合适浓度。4.5.2 荧光结合物的滴定:在己制备的弓形虫抗原玻片上滴加1: 10的弓形虫阳性血清、阴性血清和PBS对照，参照荧光结合物的工作效价做系列稀释，然后滴加以上各孔内，最后选择荧光强度为+最高稀释度的结合物为正式试验用的稀释度。4.6 操作步骤滴加待检血清(1: 10)、己知阳性、阴性血清和PBS于抗原玻片上, +保温37C30 miw_45 minC玻片置于湿盒内)-./用洗液CPBS)漂洗3次，每次5min +甩干加荧光结合物+保温37C30 min45 min 用

8、洗液CPBS)漂洗3次，每次5min.水洗l次甩干滴50%甘油PBS后，覆以盖玻片封片荧光显微镜镜检4. 7 结果记录荧光显微镜下，在抗原片上的弓形虫虫体呈黄绿荧光，以待检血清1: 10稀释检测到虫体为阳性。7 GB/T 1创48.2-20015 结果判定待检样品用一种方法检测出现可疑或阳性时，应选用同一种或另一种方法重试，重试阳性则为阳性。6 结果报告根据判定结果，作出报告。8 CON-2.叮叮;二叮叮同筒。华人民共和国家标准实验动物寄生虫学检测方法GB/ T 18448.1-18448.10-2001 国由t号峰中国标准出版社出版北京复兴门外兰里河北街16号邮政编码:100 045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售a峰开本880X1230 1/ 16 印张2字数45千字2001年12月第一版2001年12月第一次印刷印数1-2000* 定价15.00元网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 . 1- 17994