DB15 T 2726—2022 牛腹泻疾病防控操作规程.pdf

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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2726 2022 牛腹泻疾 病 防控操 作规程 Operational procedures for bovine diarrhea prevention and control 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 发 布 DB15/T 2726 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本

2、文件 起草 单位：内 蒙古 农业大 学、内蒙 古大 学、内蒙古 自治 区动 物疫 病预 防控制 中心、金 宇保 灵生物药 品有 限公 司、北京 生泰尔 科技 股份 有限 公司、内蒙 古伊 利实 业集 团股 份有限 公司。本文件 主要起 草人：徐晓 静、王 建龙、谢梦 圆、马 立峰、郭宇、王炜、魏小 军、赵 晓军、吴晓 亮、韩四娥、王 艳杰、周 伟光、王秀 敏。DB15/T 2726 2022 1 牛腹泻疾 病防控 操作规程 1 范围 本文件 规定 了牛 腹泻 疾病 的诊断 和防 治。本文件 适用 于奶 牛饲 养场（户）、肉 牛饲 养场（户）和动 物诊 疗机 构对 牛腹 泻疾病 的防 控。2 规

3、范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 4789.4 食 品安 全国 家 标准 食品 微生 物学 检验 沙门氏 菌检 验 GB 4789.6 食 品安 全国 家 标准 食品 微生 物学 检验 致泻大 肠埃 希氏 菌检 验 GB/T 16568 奶 牛场 卫生 规范 GB 19489 实验 室 生物 安 全通用 要求 GB/T 27401 实 验室 质量 控制规

4、范 动物 检疫 GB/T 27637 副 结核 分枝 杆菌实 时荧 光PCR 检 测方 法 GB/T 35942 隐 孢子 虫套 式PCR 检测 方法 NY 5047 无公 害食 品 奶 牛饲养 兽医 防疫 准则 NY/T 5049 无 公害 食品 奶牛饲 养管 理准 则 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。牛腹泻 疾病 bovine diarrhea 牛腹泻 是一 种以 消化 不良、腹泻 为主 要症 状的 消化 道疾病，引 起牛 腹泻 的病 因分为 传染 性和 非传 染性因素 两类，传染 性因素 包括病 毒、细 菌、寄生虫 等病原 体；非 传染 性因素 包括营 养、环 境

5、、管理等。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。BVDV：牛病 毒性 腹泻 病毒（Bovine viral diarrhea virus）BVD/MD：牛 病毒 性腹 泻/黏 膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease）BRV：牛轮 状病 毒（Bovine ratovirus）BCoV：牛冠 状病 毒（Bovine coronavirus）CPE：致细 胞病 变效 应（Cytopathic Effect）DB15/T 2726 2022 2 Dubos 培养 基：杜波 斯液 体培养 基（Dubos medium）E.coli：大 肠杆 菌（Esche

6、richia coli）HRT-18 细胞：人 直肠 肿瘤-18细胞（Human Rectal Tumor-18 Cell）MA104 细胞：恒 河猴 肾细 胞（Rhesus kidney cell）MDBK 细 胞：牛肾 细胞（Madin Darby Bovine Kidney Cell）5 生物安 全措 施 样品采 集的 生物 安全 措施 符合GB 19489 的 规定。样品处 理的 生物 安全 措施 符合GB/T 27401 的规 定。6 病因 感染性 腹泻 引起牛 腹泻疾 病的 主要病 原有：病毒性 病原 包括牛 病毒性 腹泻病 毒（BVDV）、牛轮 状病毒（BRV）和牛冠 状病 毒（

7、BCoV）等；细 菌性 病原 包括 致病 性 大肠杆 菌（E.coli）、沙 门菌（Salmonella）、副 结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis）等；寄 生 虫 性 病 原 包 括 球 虫（Sphaerozoum fuscum）和隐孢 子虫（Cryptosporidium parvum）等。非感染 性腹 泻 引起非 感染 性腹 泻的 主要 因素有 饲养 管理 和环 境因 素，如 消化 不良、营 养缺 乏、中 毒、应激 等。7 诊断 临床诊 断 7.1.1 流行病 学 不同年 龄和品 种牛 均可发 生，多 见于幼 龄牛，犊 白 痢

8、多发 于1月 龄内犊 牛；犊 牛副伤 寒多发 于15 月龄的 犊牛；副结 核性肠 炎多发 于成年 牛；牛病毒 性腹泻 病毒多 发于6 18 月 龄牛，牛轮状 病毒 和牛 冠状病毒 多发于1周龄 犊牛。病牛和 带菌（毒）牛是感 染性腹 泻的主 要传 染源。通过消 化道、呼吸 道、接触、胎 盘和 交配 等途 径传 播。本病 一年 四季 均可 发生，尤以气 候多 变、寒冷 季节 和 环境卫 生较 差时 多发。7.1.2 临床症 状 7.1.2.1 病毒性 腹泻 7.1.2.1.1 牛病毒 性腹 泻/黏膜 病 急性感 染牛 突然 发病，体 温升至40 42，随 体温升 高，白细 胞减 少，有的可 发生

9、 第二 次白 细胞减少。病牛 精神 沉郁、厌食，鼻、眼有 浆液 性分 泌物，2 d 3 d 内 可能 有 鼻镜及 口腔 黏膜 表面 糜烂，舌面上 皮坏 死、流 涎增 多、呼气恶 臭，通 常在 口腔 损 害之后 发生 严重 腹泻，病 初水泻，后带 黏液、血 液，甚至脱 落的 黏膜。部 分病 牛出现 蹄叶 炎及 趾间 皮肤 糜烂坏 死，导致 跛行。慢性病 例常 出现 鼻镜 糜烂，眼 部常 有浆 液性 分泌 物。门齿齿 龈通 常发 红，典 型 的临床 症状 是由 于蹄叶炎及 趾间 皮肤 糜烂 坏死 而致的 跛行。通 常皮 肤呈 屑状，在髻 甲、颈部 及耳 后最明 显。DB15/T 2726 2022

10、 3 母牛妊 娠期 感染 后流 产，或产先 天性 缺陷 犊牛，最 常见的 缺陷 是小 脑发 育不 全。7.1.2.1.2 牛轮状 病毒 性腹 泻 犊牛感 染后12 h 24 h 出 现严重 腹泻，发病 突然，病初表 现为 精神 不振、厌 食和腹 泻，体 温正 常 或略高，排黄 白色 稀便，有 时带有 黏液 和血 液。病程 长者脱 水明 显，严重 者常 有死亡。成 年牛 多呈 隐 性 感染，并 在一 定时 间持 续向 外界排 毒。7.1.2.1.3 牛冠状 病毒 性腹 泻 犊牛感 染后 发生 腹泻，发 病 初期出 现带 血的 黄色 黏性 粪便，后期 发展 为水 泻，有 时出现 脱水、虚 弱、体温

11、低，少数 犊牛 出现发 热、卧 地不起 等症 状，严 重的犊 牛会出 现昏 迷甚至 死亡。成年牛 常突 然暴发，排出深 褐色 带血 稀粪，伴 有产奶 下降、沉 郁及 厌食 等症状。7.1.2.2 细菌性 腹泻 7.1.2.2.1 犊白痢 病牛初 期体 温升 高达41 42，有 的犊 牛出 生后 数小时 开始 腹泻。初期 粪 便呈粥 样、白 色或 黄白色，后期 呈水 样、灰 白 色，混 有未 消化 的凝 乳块、血液 及泡 沫，有 酸臭 味。末期 患病 牛伴 有腹 痛，用蹄踢腹 壁。可发 生脐 炎或 关节炎，偶 见肺 炎。耐 过 病牛发 育迟 缓。有时 可见 神经症 状，兴奋 不安，有 些病例可

12、突然 死亡。7.1.2.2.2 犊牛副 伤寒 主要由 鼠伤 寒沙 门菌 和肠 炎沙门 菌引 起。犊牛多 发病 突然，病初 体 温升高 至40 41，24 h 后 排出 灰黄 色稀 便，混 有黏液 和血 丝，一 般于出现 症状 后5 d 7 d 内 死亡。病程 长者 可能 会出 现腕 关 节和 跗关 节肿 大。成年牛 感染 表现 高热、昏 迷、食欲 废绝、呼 吸困 难，发病后12 h 24 h 粪 便中 带有血 块，随 即腹 泻。粪便恶 臭，含有 纤维 素絮 片。病 牛常 死于 高热 期后。病程 长者 可见 脱水、消 瘦、眼 窝下 陷，黏 膜充 血 发黄。妊 娠牛 多流 产。7.1.2.2.3

13、副结核 性肠 炎 潜伏期 较长，一 般多 见于2 5岁 成年 牛，发病 初期 为 间歇性 腹泻，逐 渐变 为顽 固性腹 泻，腹泻 呈喷射状水 样便，排泄 物稀 薄、恶臭，带 有气 泡、黏液。体 温常无 变化，病程 长者 可 见显著 消瘦，皮下 水肿。7.1.2.3 寄生虫 性腹 泻 7.1.2.3.1 球虫病 感染牛 精神 不振、食 欲下 降、腹 泻，病情 加剧 时体 温升至41 左 右，发病 后 期出现 贫血，体 温 下降至35 36，后肢 和肛门 周围 被血 粪污 染。7.1.2.3.2 隐孢子 虫病 发病后 主要表 现为 腹泻，食欲下 降，严 重脱 水，在 腹泻期 间的犊 牛失 去吃乳

14、能力，饮水欲 望增 加。7.1.3 病理变 化 7.1.3.1 病毒性 腹泻 DB15/T 2726 2022 4 7.1.3.1.1 牛病毒 性腹 泻/黏膜 病 整个口 腔可 见糜 烂灶。典 型病变 是食 管黏 膜糜 烂斑 呈纵行 排列。胃 黏膜 可见 出血、糜烂。小 肠黏 膜肿胀、出 血，黏 膜脱 落甚 至 形成黏 膜管 套，肠 内容 物 含有黏 液、血 液和 脱落 黏 膜，尤以 空肠 和回 肠严 重。肠系膜 淋巴 结肿 胀、充血、出血 和水 肿。7.1.3.1.2 牛轮状 病毒 性腹 泻 牛轮状 病毒 感染 病理 变化 主要表 现在 消化 肠道，肠腔 内充满 凝乳 块和 乳汁，小肠 肠壁

15、变 薄、半 透明，肠内容 物呈 液状、灰 黄或 灰黑色。7.1.3.1.3 牛冠状 病毒 性腹 泻 小肠肠 壁变 薄、透明，肠 腔液体 增多，严 重者 引起 腹腔积 水，胃内 有未 消化 的凝乳 块。感染 的牛 可能伴随 呼吸 道症 状，表现 为气管 黏膜 充血、局 限性 肺炎等。7.1.3.2 细菌性 腹泻 7.1.3.2.1 犊白痢 剖检可 见皱 胃和 小肠 黏膜 充血、水肿 和出 血，皱胃 内有大 量凝 乳块，黏 膜表 面覆盖 胶状 黏液。肠 内容物常 混有 血液 和气 泡，恶臭。肠 系膜 淋巴 结肿 大。经脐带 感染 的病 例可 见出 血性脐 炎和 出血 性脐 动脉炎。病 程长 者伴

16、有浆 液纤 维 素性关 节炎 和出 血性 或浆 液出血 性肺 炎。突然 死亡 的 病例常 无明 显病 理变 化。7.1.3.2.2 犊牛副 伤寒 剖检可 见肠 内容 物稀 薄，混 有黏液 和血 液，呈咖 啡色。病程较 长时，小 肠可 见浮 膜 性与固 膜性 肠炎，肠系膜 淋巴结 呈不 同程度 的水肿、出血。皱 胃黏膜 充血、水肿，表面 被覆大 量黏液，有时 可见 出血点。脾脏明 显肿 大而 柔软，呈 灰红或 暗红 色，边缘 钝圆，被膜 紧张，可 见出 血斑 点和粟 粒大 的坏 死灶。肝 脏肿大，质地 柔软，被 膜下 散在针 尖大 的灰 黄或 灰白 色病灶。7.1.3.2.3 副结核 性肠 炎

17、剖检可 见尸 体极 度消 瘦，可视黏 膜因 贫血 呈苍 白色，被 毛粗 乱无 光。特 征性 病 变为慢 性增 生性 肠炎及相应 的淋 巴结 炎。病变 多集中 于空 肠、回肠 和结 肠前段。病 变肠 管变 粗，肠腔狭 窄，黏膜 覆盖 一 层 灰白色黏 稠的糊 状物。肠黏 膜增厚2 30 倍，折 叠形 成 脑回样 皱襞。病变 部肠管 的浆膜 淋巴管 和相 应的 肠系膜淋 巴管 扩张、增 粗，呈弯曲 的细 绳索 状，肠系 膜淋巴 结肿 胀。7.1.3.3 寄生虫 性腹 泻 7.1.3.3.1 球虫病 以出血 性肠炎 为特 征，消 瘦，可 视黏膜 苍白，小肠 后段、盲肠和 结肠 内充满 半凝固 的血样

18、 内容 物，肠黏膜 肿胀、增 厚或 糜烂 性 坏死，淋巴 滤泡 肿大，有 白 色或灰 色小 病灶 和溃 疡，表 面有 凝 乳状 薄膜 覆盖。直肠内 容物 呈褐 色、恶臭，有纤 维素 性薄 膜和 黏膜 碎片。肠系 膜淋 巴结 肿大。7.1.3.3.2 隐孢子 虫病 剖检可 见腹 腔内 蓄积 大量 液体，呈 淡黄 或微 黄色，皱 胃黏膜 表面 存在 出血 点和 出血斑，回肠 黏膜 存在大面 积的 出血 斑。7.1.4 结果判 定 DB15/T 2726 2022 5 出现7.1.1、7.1.2、7.1.3，可判 定为 牛腹 泻疾 病疑 似病例。实验室 诊断 7.2.1 主要仪 器设 备 电镜、低温

19、 高速 离心 机、倒置显 微镜、CO2 细胞 培养 箱、恒 温细 菌培 养箱、PCR 仪、电 泳仪、凝胶 成像仪。7.2.2 主要试 剂 PBS、2%磷钨 酸、胰 酶、MA104 细胞、MDBK 细胞、HRT-18细胞、细菌 微量 生化反 应管及 指示剂、PCR Taq酶。7.2.3 样品采 集 7.2.3.1 粪便样 品 将棉拭 子伸 入肛 门内 刮取 新鲜粪 便，放 入装 有3 mL PBS 采样 管中；也可 无菌采 集地上 刚排 出新 鲜 粪便。编 号并 记录 相关 信息。7.2.3.2 组织样 品 取病死 牛肠 道及 内容 物、肝、脾、淋 巴结 等，置于 无菌密 封袋 或采 样杯 内。

20、7.2.4 样品处 理 7.2.4.1 用于病 毒检 测：对于 粪便 样品，放入 盛 有 3 mL PBS 管中，充分 振荡，12000 r/min 4 离心5 min 8 min，取 上清 备用；对于 组织 样品，称 取 1 g 置 于研 钵，充分 研 磨后 加 5 mL PBS，混 匀，8000 r/min 4 离心 5 min，取上 清备 用。将上 清 于0.22 m 滤 器过 滤，-80 冰箱 保存 或直 接接种细胞。7.2.4.2 用于细 菌检测：将 粪便样 品漩涡 震荡，用无 菌接种 环接种 于增菌 培养 基；组 织样品 直接取 少许加入 增菌 培养 基，于细 菌培养 箱 中37

21、培养 18 h 24 h。7.2.4.3 用于寄 生虫 检测：称 取 1 g 粪便 于烧 杯中，用 于形 态学检 测。7.2.5 病原检 测 7.2.5.1 病毒检 测 7.2.5.1.1 电镜检 查 将采集 的粪 便或 肠内 容物 用 PBS 制成1:4 悬液，于 盛有玻 璃珠 的管 内充 分震 荡30 min，取悬 液3000 r/min 离心30 min，取 上清，15000 r/min离心30 min，取上 清，以40000 r/min 50000 r/min 离心3 h 5 h，弃上 清，加12滴 蒸 馏水悬 浮管 内沉 淀，滴加 铜网，2%磷 钨酸 染色，电 镜下观 察病 毒粒 子

22、形 态。7.2.5.1.2 病毒分 离鉴 定 将处理 的样 品接 种适 宜细 胞（MA104 细胞、MDBK 细 胞、HRT-18 细 胞）进行 病 毒分离 培养，根 据中和试验（固 定血 清-稀释 病 毒法）进行 病毒 鉴定。7.2.5.1.3 PCR 检测 DB15/T 2726 2022 6 应用普 通或 荧光 定量PCR/RT-PCR 方法 进行 病原 核酸 检 测。采 用常 继涛 文章“牛 轮 状病毒 病原 流行 病学调查、基因重配毒株的构建及二价减毒株的免疫原性评价”中BRV 引物序列：BRV-VP6-F：GACGGAGCGACTACATGGT；BRV-VP6-R：GTCCAATT

23、CATACCTGGTGG；采用 常继 涛等 人 文章“载牛 冠状 病毒 N 蛋白壳 聚糖 微球 的免 疫效 果评价”中BcoV 引物 序列：BCoV-N-F：GCAATCCAGTAGTAGAGCGT；BCoV-N-R：CTTAGTGGCATCCTTGCCAA；采 用 彭 雪 松 论 文“BVDV 基 因 分 型 检 测 方 法 的 建 立 及 应 用”BVDV-F：TAGCCATGCCCTTAGTAGGAC；BVDV-R：CTCCATGTGCCATGTACAGCA。7.2.5.2 细菌检 测 7.2.5.2.1 细菌分 离 将采集 的粪 便或 组织 样品，用相 应细 菌培 养基 培养。大肠杆

24、菌用 伊红 美蓝 琼脂 或麦康 凯琼 脂培 养基 培养；沙门 菌用SS培 养基、HE 琼脂培 养基 或去 氧 胆盐钠-枸 橼酸 盐培养 基培 养；副结 核分枝 杆菌 初代分 离困难，在病 变肠 段及肠 淋巴结 分离率 较高，可 先用4%H2SO4 或 2%NaOH 处 理，再 用Dubods 培养 基上 或HEYM 培养 基培 养。7.2.5.2.2 染色镜 检 将分离 纯化 的大 肠杆 菌和 沙门菌 进行 革兰 染色，副 结核分 枝杆 菌可 用抗 酸染 色法，显微 镜下 观察 细菌形态。大 肠杆 菌和 沙门 菌镜下 为粉 红色 杆菌，副 结核分 支杆 菌镜 下可 观察 到呈单 个或 分支 状

25、排 列 的 红色细长 杆菌。7.2.5.2.3 生化鉴 定 将分离 纯化 的菌 用相 应的 生化鉴 定管 进行 生化 特性 鉴定，根据 伯杰 细菌 手册 统计结 果。也可 用全 自动微生 物生 化鉴 定系 统进 行鉴定。7.2.5.2.4 血清学 鉴定 7.2.5.2.4.1 致病性 大肠 杆菌 血清 学鉴 定 按照GB 4789.6 对致 病性 大 肠杆菌 进行 血清 学鉴 定及 结果判 定。7.2.5.2.4.2 沙门菌 血清 学鉴 定 按照GB 4789.4 对沙 门菌 进 行血清 学鉴 定及 结果 判定。7.2.5.2.5 分子检 测 7.2.5.2.5.1 致病性 大肠 杆菌 PCR

26、 检测 按照GB 4789.6 对致 病性 大 肠杆菌 进行PCR 检测 及结 果 判定。7.2.5.2.5.2 沙门 菌PCR 检测 根据沙 门菌 毒力 基因inv A 设计引 物。参考 李文 豪论 文“呼 和浩 特牛 腹泻 部分 细菌性 病原 检测 及 三重PCR 检测 方法 的建 立”中 的引物 序列：F：CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA；R：TAGACAGGGCGGAGGACAAATC。7.2.5.2.5.3 副结核 分枝 杆菌 PCR 检测 按照GB/T 27637 对副 结核 分枝杆 菌进 行PCR 检 测及 结 果判定。7.2.5.3 寄生虫 检测 DB15/T 27

27、26 2022 7 7.2.5.3.1 饱和盐 水漂 浮法 配制饱 和盐 水，称取1 g 粪 便于烧 杯中，加 入12 mL29 mL 的 饱和 盐水，饱 和盐 水于管 口形 成凸 液面，载 玻片 盖在 管口30 min，显 微镜 下观 察球 虫卵 囊 形态并 计数。7.2.5.3.2 直接涂 片染 色 将粪便 涂片，室 温滴 加10%NaOH 1 min 后 水洗，采 用 金胺-酚改 良抗 酸复 染法 进 行染色 镜检。显 微镜下观 察隐 孢子 虫卵 囊形 态。7.2.5.3.3 分子检 测 用特异 性引 物进 行病 原的 普通或 荧光 定量 PCR 检 测。采用 王晓 丹论 文“牛腹 泻部

28、分 寄生 虫性 病 原检 测 方 法 的 建 立 及 应 用”中 球 虫 引 物 序 列：ITS-2-F：TGAAGAGCTGTGATGGCGTT，ITS-2-R：TTCTCTTTTGATTGCGTTGCT；隐孢 子虫 参照GB/T 35942 进行PCR 检 测及 结果 判定。综合判 定 7.3.1 疑似 符合7.1.1、7.1.2、7.1.3，可判 定为 牛腹 泻疾 病疑 似病例。7.3.2 确诊 符合7.1.1、7.1.2、7.1.3，经实 验室 诊断 任一 检测 结果为 阳性 可判 定为 牛腹 泻疾病。8 预防 加强饲 养管 理，保持 卫生 清洁。按 照GB/T 16568 和 NY/

29、T 5049 的 规定。加强产 房消 毒卫 生，产房 需要保 暖、宽敞、通 风、干 燥，产 犊过 程中 排出 物及 时清除，随 时消 毒。在保证 舍内 温度 的前 提下，自然 通风，保 证牛 舍干 燥、舒 适、温暖。避免应 激，消除 可能 降低 机体抵 抗力 的各 种应 激因 素。自然哺 乳母 牛定 期消 毒乳 头，防 止致 病微 生物 传染 犊牛。分娩时，落 地犊 牛口 鼻切 勿接触 脏污。初生犊 牛及 时哺 喂初 乳。犊牛出 生 后1 h 内 灌服经 巴氏消 毒的 初 乳 4 L，奶 温36 38，12 h 后视 情况 可再 饲喂2 L。哺乳犊 牛给 予开 食料，补 充微量 元素，饲 料配

30、 比适 当。牛群防 疫参 照NY 5047 的 规定。可注射 牛轮 状 病 毒疫 苗、牛病毒 性腹 泻病 毒疫 苗等，随 着国 内疫 苗种 类的 丰 富，及时 调整 免疫 程序。病死或 死因 不明 牛按 照 病死及 病害 动物 无害 化处 理技术 规范 及 病 死畜 禽 和病害 畜禽 产品 无害化处 理管 理办 法 的规 定处理。9 治疗 抗菌治 疗 根据细 菌学 诊断 及药 敏试 验结果 选择 敏感 抗生 素进 行治疗。DB15/T 2726 2022 8 微生态 制剂 治疗 改善机 体消 化道 内环 境，调节微 生态 平衡。中医治 疗 清除肠 道毒 素，调节 菌群，维持 肠道 菌平 衡，改善 肠道循 环。对症治 疗 用收敛 止泻 剂止 泻，内服 保护剂 和吸 附剂，保 护肠 黏膜。寄生 虫感 染采 用驱 虫药物 治疗。根 据临 床症状进 行静 脉补 液或 口服 补液，根据 脱水 状况，调 节补液 速度，纠 正休 克和 机体酸 中毒，同 时补 充 各 种维生素 和能 量。