SN T 4624.20-2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第20部分：泛养副球菌.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.20 2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第 20 部分：泛养副球菌 Test method of import microbe agentia in the environment protection - Part 20: Paracoccus pantotrophus 2021-06-18 发布 2022-01-01 实施 ICS 11.020 CCS C 62 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 31 千字 202

2、1 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175327 定价 18.00元 入境环保用微生物菌剂检测方法 第 20 部分：泛养副球菌 行 业 标 准 SN/T4624.202021 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址 以正式出版文本为准 SN/T 4624.20 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 本文件为 SN/T 46

3、24入境环保用微生物菌剂检测方法的第 20 部分。SN/T 4624 已经发布了以 下部分： 第 1 部分：地衣芽孢杆菌 第 2 部分：短小芽孢杆菌 第 3 部分：巨大芽孢杆菌 第 4 部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 第 5 部分： 型溶血性链球菌 第 6 部分：金黄色葡萄球菌 第 7 部分：沙门氏菌 第 8 部分：志贺氏菌 第 9 部分：致泻大肠埃希氏菌 第 10 部分：淡紫拟青霉 第 11 部分：雅致小克银汉霉 第 12 部分：哈茨木霉 第 13 部分：黄孢原毛平革菌 第 14 部分：焦曲霉 第 15 部分：解淀粉芽孢杆菌 第 16 部分：类产碱假单胞菌 第 17 部分：恶臭假单胞菌 第 18

4、部分：短短芽孢杆菌 第 19 部分：红串红球菌 第 20 部分：泛养副球菌 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国沈阳海关、诺微信（沈阳）生物技术有限公司。 本文件主要起草人：王金玲、张莹、李秀峰、王旭、于丽、张淼 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 4624.20 2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第 20 部分 泛养副球菌 1 范围 本文件规定了入境环保用微生物菌剂泛养副球菌（ Paracoccus pantotrophus）的检测方法。 本文件第一法适用于入境环保用微生物菌剂泛养副球菌的定性检测；第二法适用于入境环保用 微生物菌

5、剂中泛养副球菌的定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 泛养副球菌分类地位 学名： Paracoccus pantotrophus。 曾用名： Thiosphaera pantotropha。 分类地位：科（aerobic chemolithotrophicbacteriaandassociatedorganism）

6、，球硫细菌属（ Thiosphaera）。 5 方法原理 分离纯化菌株后，进行形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光 PCR 检测，根据菌的形态特征结果、 生化鉴定结果、实时荧光 PCR 特异性片段扩增结果，3 项结果都符合时判断该菌为目标菌株。 6 主要仪器和设备 6.1 电子天平（感量 0.01 g）。 6.2 恒温培养箱：35 1 。 6.3 恒温振荡培养箱：35 1 。 6.4 腕式振荡器。 6.5 恒温水浴锅。 6.6 台式冷冻离心机（最高转速 15 000r/min）。 以正式出版文本为准 2 SN/T 4624.20 2021 6.7 实时荧光 PCR 扩增仪。 6.8 生物显微镜：10

7、100。 6.9 微量移液器和灭菌吸头：10 L、20 L、200 L、1 000L。 6.10 高压灭菌锅。 6.11 PCR 超净工作台。 6.12 电泳仪。 6.13 核酸 / 蛋白分析仪。 6.14 凝胶成像系统。 6.15 无菌培养皿：直径 90 mm。 7 主要试剂和培养基 7.1 实验用水（应符合 GB/T 6682 中一级水的规格）。 7.2 磷酸盐缓冲液：按附录 A 中 A.1 配制。 7.3 硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂：按附录 A 中 A.2 配制。 7.4 接触酶：按附录 A 中 A.3 配制。 7.5 氧化酶：按附录 A 中 A.4 配制。 7.6 甲基红试验：按附录

8、A 中 A.5 配制。 7.7 糖发酵管：按附录 A 中 A.6 配制。 7.8 硝酸盐还原试验培养基：按附录 A 中 A.7 配制。 7.9 淀粉水解试验培养基：按附录 A 中 A.8 配制。 7.10 TE 缓冲液（pH 值 8.0）：按附录 A 中 A.9 配制。 7.11 1%3% 琼脂糖凝胶：按附录 A 中 A.10 配制。 7.12 25mMEDTA ：按附录 A 中 A.11 配制。 7.13 3M 醋酸钠：按附录 A 中 A.12 配制。 7.14 dNTP ：dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 7.15 TBE ：按附录 A 中 A.13 配制。 7.16 TaqDNA

9、 聚合酶。 7.17 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 7.18 琼脂糖。 7.19 溴化乙锭。 7.20 DNA 分子量标记：100 bpDNAladder。 第一法 泛养副球菌定性检测 8 样品制备、培养 8.1 以无菌操作称取 1 g（mL）样品加入到 99 mL 无菌磷酸盐缓冲液中，在室温下用腕式振荡器震 荡 10 min，振荡器震荡速率 300 次 /min400 次 /min，制成 1 : 100 的样品匀液。取样过程中，在样品 旁边放置 1 个营养琼脂平板作为空白对照。 8.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1 : 100 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 m

10、L 无菌磷酸 盐缓冲液的无菌试管中 ( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 )，并在振荡器上进行振摇，至少振 摇 15 s，制成 1 : 1000 的样品匀液。 以正式出版文本为准 3 SN/T 4624.20 2021 8.3 按8 .2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。 8.4 根据对样品菌量的估计，选择 2 个 3 个适宜稀释度的样品匀液，在进行 10 倍递增稀释的同时， 每个稀释度分别移取 1 环菌连续划线接种 5 个硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂平板，35 1 培养 48h。取样过程中，在样品旁边放置 1 个营养琼脂平板作为空白对照。

11、9 形态学鉴定 9.1 培养性状 泛养副球菌在硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂上的菌落圆形、颜色大多数为白色、淡黄色，表面 光滑，边缘整齐。 9.2 形态特征 革兰氏染色：将 8.4 中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。泛养副球菌为革兰氏阴性短 杆状或球形、近球形的菌，不运动，不形成芽孢。 10 生化鉴定 也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等。 取 8.4 中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入 100 L 增菌肉汤。 泛养副球菌生化特征见表 1。 表 1 泛养副球菌生化特征 鉴定项目 泛养副球菌 接触酶 + 氧化酶 + 甲基红试验 甘露糖 葡萄糖 - 硝酸盐还原

12、+/- 淀粉水解 11 分子生物学检测 11.1 细菌模板 DNA 的提取 11.1.1 直接提取法 取 8.4 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如果肉 眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE 100L、10 mg/mL 溶菌酶 100 L，37 温育 30 min，12 000r/min 离心 2 min，沉淀加入 TE 缓冲液 600 L 重悬，再加入 15 mg/mL 蛋白酶 25 L，55 温育 1 h 后沸水浴 10 min，12 000r/min 离心 5 min，取上清液保存于 -

13、20保存以待检测。 11.1.2 有机溶剂提取法 取 8.4 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如 果肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE 缓冲液 570 L 重悬，然后 以正式出版文本为准 4 SN/T 4624.20 2021 加入 10 mg/mL 溶菌酶 100 L，37 温育 30 min，再加入 10 %SDS30L，65 温育 10 min，加入 等体积的酚混匀，12 000r/min 离心 10 min，取上清液移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后 取上清液加等体积的酚氯仿

14、（11，体积比）混匀，12 000r/min 离心 10 min，取上清液再移入一 新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12 000r/min 离心 10min，弃上清液，沉淀用 500 L75% 乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加入 100L 无菌水（预先加热至 65 有利于 DNA 溶解）， -20保存以待检测。 11.1.3 试剂盒法 使用商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 11.1.4 DNA 质量检测 用核酸 / 蛋白分析仪分别在 260 nm 和 280 nm 下测定 OD 值，用

15、于实时荧光 PCR 反应的 DNA 纯 度一般为 1.6 OD 260 /OD 280 2.0。 DNA纯度 =OD 260 /OD 280 DNA浓度（mg/mL）=50OD 260 11.2 实时荧光 PCR 鉴定 11.2.1 引物和探针序列 引物和探针序列见表 2。其中探针的 5 null 端标记 FAM，3 null 端标记 TAMRA。 表 2引物和探针序列 鉴定菌名称 引物序列 探针序列 泛养副球菌 (ccdA) GenBankAF308446.1 5null CAGCCTTCCACGAAAGAGTGA-3null 5nullFAM-CCCTTTCCATGAGCCAA-TAMRA

16、3null 5null GCATCTGCAAGCTCGATTCC-3null 11.2.2 实时荧光 PCR 反应体系 实时荧光 PCR 反应体系见表 3。 表 3实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称 实时荧光 PCR 反应体系 2.5Real MasterMix 12.5L 正向引物（10 pmol/L） 1L 反向引物 (10pmol/L) 1L 探针 (5pmol/L) 1L DNA 模板 2L（约 50 ng200ng） 50ROX ReferenceDye*3 0.25L ddH 2 O 补充至 25 L 注 1 ：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

17、注 2 ： 50ROX ReferenceDye*3荧光试剂仅在具有 ROX 校正通道的实时荧光 PCR 仪上进行扩增添加，否则用 超纯水补足。 注 3 ：检测样品设置两个平行反应。 以正式出版文本为准 5 SN/T 4624.20 2021 11.2.3 实时荧光 PCR 反应参数 实时荧光 PCR 反应参数见表 4。 表 4 实时荧光 PCR 反应参数 循环 步骤 温度/ 时间 内容 1 1 94 15min 起始模板变性 40 2 94 3s PCR 循环中模板变性 3 56 32s 退火延伸 注 1 ：使用不同实时荧光 PCR 仪，可对参数作适当调整。 注 2 ： 设置实时荧光 PCR

18、 反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪 器使用说明书。 11.2.4 空白对照、阴性对照和阳性对照设置 11.2.4.1 阴性对照：非泛养副球菌 DNA 为模板。 11.2.4.2 阳性对照：已知泛养副球菌的 DNA 或含有待测基因序列的质粒为模板（见附录 B）。 11.2.4.3 空白对照：设两个，一是提取 DNA 时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是 实时荧光 PCR 反应的空白对照。 11.2.5 实时荧光 PCR 扩增结果判定 11.2.5.1 对照结果 11.2.5.1.1 阴性对照：无扩增曲线。 11.2.5.1.2 阳性对照：出现典

19、型的扩增曲线， Ct 值应 30.0。 11.2.5.1.3 空白对照：无扩增曲线。 11.2.5.1.4 否则，检测视为无效。 11.2.5.2 结果判定 11.2.5.2.1 Ct 值大于等于 40.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阴性。 11.2.5.2.2 Ct 值小于等于 35.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阳性。 11.2.5.2.3 Ct 值大于 35.1 且小于 40.0，建议重做。再次扩增后的外源基因 Ct 值仍小于 40，且曲线 有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后 外源基因 Ct 值大于 40，且阴性对

20、照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。 12 结果报告 12.1 形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果均符合时，报告检出泛养副球菌。 12.2 形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测有一项不符合时，建议重做。仍有不符合时，报告未 检出泛养副球菌。 以正式出版文本为准 6 SN/T 4624.20 2021 第二法 泛养副球菌定量检测 13 样品稀释 13.1 以无菌操作称取 1 g（mL）样品加入到 99 mL 无菌磷酸盐缓冲液中，在室温下用腕式振荡器振 荡 10 min，振荡器振荡速率 300400 次 /min，制成 1100 的样品匀液。取样过程中，在样品旁边放 置 1 个营养

21、琼脂平板作为空白对照。 13.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1100 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 无菌磷 酸盐缓冲液的无菌试管中 ( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 )，并在振荡器上进行振摇，至少 振摇 15 s，制成 11000 的样品匀液。 13.3 按 13.2 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管 或吸头。 14 样品接种 根据对样品菌量的估计，选择 2 个 3 个适宜稀释度的样品匀液，在进行 10 倍递增稀释的同时， 每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL、0.3 mL、0.

22、4 mL接种量分别加入到硫酸链霉素胰蛋白 胨大豆琼脂平板，然后用无菌涂布棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如硫酸链霉素 胰蛋白胨大豆琼脂平板表面有水珠，可适当放置以肉眼可见无水珠。 15 培养 在通常情况下，涂布后，将平板静置 10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱 35 1 条件下培养 1 h ；等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于 35 1 条件下培养 48 h。 16 菌落计数和确认 选择硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂上的菌落圆形、颜色大多数为白色、淡黄色，表面光滑，边 缘整齐，同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 CFU200CFU 之间的平板，计数典型菌落数。

23、 从典型菌落中至少选 5 个可疑菌落（小于 5 个全选）进行鉴定试验。分别做染色镜检，生化鉴定 （见第 10 章）；同时接种营养肉汤，35 1 条件下培养 48 h，进行分子生物学检测（见第 11 章）。 17 结果计算 17.1 若只有一个稀释度平板的典型菌落数在 20 CFU200CFU 之间，计数该稀释度平板上的典型菌 落，按式（1）计算。 T= AB Cd （1） 式中： T样品中泛养副球菌菌落数； A某一稀释度典型菌落的总数； B某一稀释度鉴定为阳性的菌落数； C某一稀释度用于鉴定试验的菌落数； d稀释因子。 以正式出版文本为准 7 SN/T 4624.20 2021 17.2 若最

24、低稀释度平板的典型菌落数小于 20 CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落，按式（1） 计算。 17.3 若某一稀释度平板的典型菌落数大于 200 CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，计数该稀 释度平板上的典型菌落，按式（1）计算。 17.4 若某一个稀释度平板的典型菌落数大于 200 CFU，而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在 20CFU200CFU 范围内，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式（1）计算。 17.5 若 2 个连续稀释度的平板典型菌落数均在 20 CFU200CFU 之间，按式（2）计算。 T= A 1 B 1 /C 1 +A 2 B 2 /C 2 1.1d （2） 式

25、中： T 样品中泛养副球菌菌落数； A 1 第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数； B 1 第一稀释度（低稀释倍数）鉴定为阳性的菌落数； C 1 第一稀释度（低稀释倍数）用于鉴定试验的菌落数； A 2 第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数； B 2 第二稀释度（高稀释倍数）鉴定为阳性的菌落数； C 2 第二稀释度（高稀释倍数）用于鉴定试验的菌落数； 1.1计算系数； d 稀释因子（第一稀释度）。 18 结果报告 根据公式计算结果，报告每 g（mL）样品中泛养副球菌数，以 CFU/g（mL）表示；如 T 值为 0， 则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告。 以正式出版文本为准 8 SN/T 46

26、24.20 2021 附 录 A （规范性） 培养基和试剂 A.1 磷酸盐缓冲液 A.1.1 成分 磷酸二氢钾（KH 2 PO 3 ） 34.0g 蒸馏水 500mL A.1.2 制法 贮存液：称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 mL 蒸馏水中，用大约 175 mL 的 1 mol/L 氢氧化钠溶 液调节 pH 值至 7.20.2，用蒸馏水稀释至 1 000mL 后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液 1.25 mL，用 蒸馏水稀释至 1000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌 15 min。 A.2 硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂 A.2.1 成分 胰蛋白胨 15g/L 大豆蛋白胨 5

27、g/L 氯化钠 5g/L 琼脂粉 15g/L pH 值 7.30.2 A.2.2 制法 灭菌锅中 121 下灭菌 15 min。灭菌后在 45 50 水浴锅中冷却，加入准备好的硫酸链霉素 试剂，加入量为每 1 L 培养基中加入 10 mL 试剂，使硫酸链霉素最终浓度为 50 g/mL。在无菌室中 将培养基倒入无菌平皿中。冷却凝固，确保平皿在使用前表面干燥。暂时不使用的培养基放入冰箱存 储备用。 A.3 接触酶 A.3.1 成份 3% 过氧化氢溶液。 A.3.2 制法 挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加 3 % 过氧化氢溶液 2 mL，观察结果。 A.4 氧化酶 A.4.1 成份

28、 A.4.1.1 1% 盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。 A.4.1.2 1%- 萘酚 - 乙醇溶液。 以正式出版文本为准 9 SN/T 4624.20 2021 A.4.2 制法 取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深； 再加 - 萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色，阴性于两分钟内不变色。 以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。 A.5 甲基红 (MR) 试验 A.5.1 成份 甲基红 10mg 95% 乙醇 30.0mL 蒸馏水 20.0mL A.5.2 制法 10mg 甲基红溶于 30 mL9

29、5% 乙醇中，然后加入 20 mL 蒸馏水。 A.5.3 试验方法 取适量琼脂培养物接种接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，36 1 培养 2 d5d。滴加甲基红试 剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。 A.6 糖发酵管 A.6.1 成份 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 3g 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 12H 2 O) 2g 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH 值 7.4 A.6.2 制法 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，校正 pH 值至 7.40.2。按 0.5 % 加入葡萄糖，分装于有一个 倒置小管的小试管内，121 高压灭菌 15 min。

30、 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶 100 mL，121 高压灭菌 15 min。另将各种糖类 分别配好 10 % 溶液，同时高压灭菌。将 5 mL 糖溶液加入于 100 mL 培养基内，以无菌操作分装小试管。 A.6.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于 36 1 培养，一般观察 2 d3d。迟缓反应需观察 14 d30d。 A.7 硝酸盐还原试验培养基 A.7.1 成份 硝酸钾 0.2g 以正式出版文本为准 10 SN/T 4624.20 2021 蛋白胨 5g 蒸馏水 1000mL pH 值 7.4 A.7.2 制法 溶液，校正 pH 值，分装试管，每管约 5 m

31、L，121 高压灭菌 15 min。 A.7.3 硝酸盐还原剂 甲液：将对氨基苯磺酸 0.8 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。 乙液：将甲萘胺 0.5 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。 A.7.4 试验方法 接种后在 36 1 培养 1 d4d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐 时立刻或数分钟内显红色。 注： 本试验阴性的原因有三：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生 长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。 A.8 淀粉水解试验培

32、养基 A.8.1 成分 蛋白胨 5g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 可溶性淀粉 20g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL pH 值 7.4 A.8.2 制法 用少量水先将可溶性淀粉溶解，其他成分溶化在蒸馏水中，校正 pH 值。115 高压灭菌 15 min。 A.8.3 试验方法 将细菌划线接种于可溶性淀粉琼脂平板上，在 37 培养 24 h。取出平板，在菌落处滴加碘液少 许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌的菌落周围有透 明的环 ( 即淀粉酶阳性 )。 A.9 TE 缓冲液（pH 值 8.0） A.9.1 成份 Tris 碱 1.21g Na 2 EDT

33、A2H 2 O 1.86g 去离子水 1000mL A.9.2 制法 在 800 mL 去离子水中，依次加入以上成分，校正 pH 值至 8.0，用去离子水定容到 1 L，分装后 以正式出版文本为准 SN/T 4624.20 2021 121高压灭菌 15 min。 A.10 1%3% 琼脂糖凝胶 A.10.1 成份 琼脂糖 13g 0.5TBE 100mL A.10.2 制法 在 100 mL 的 0.5TBE 中，加入琼脂糖，在微波炉中加热熔化。待溶液冷却至 60 左右，灌注 模具冷却形成。 A.11 25 mM EDTA A.11.1 成份 Na 2 EDTA2H 2 O 46.525g

34、去离子水 1000mL A.11.2 制法 在 800 mL 去离子水中，加入 Na 2 EDTA2H 2 O，充分搅拌，用 NaOH 校正 pH 值至 8.0，加去离子 水定容到 1 L，分装后 121 高压灭菌 15 min。 A.12 3M 醋酸钠 A.12.1 成份 NaAC3H 2 O 40.8g 去离子水 100mL A.12.2 制法 在 40 mL 去离子水中，加入 NaAC3H 2 O，充分搅拌，用冰醋酸调节 pH 值至 5.2，加去离子水定 容到 100 mL，分装后 121 高压灭菌 15 min。 A.13 TBE A.13.1 成分 Tris 54.0g 硼酸 27.

35、5g 去离子水 800mL 0.5mol/LEDTA（pH 值 8.0） 20mL A.13.2 制法 54gTris，27.5 g 硼酸，800 mL 去离子水溶解，20 mL0.5mol/LEDTA（pH 值 8.0）定容至 1 L。 以正式出版文本为准 SN/T 4624.20 2021 附 录 B （资料性） 泛养副球菌基因序列 (GenBank AF308446.1) 601 ccgcgccgcc gcacccggac gcgccgccgc aagccggaag aaccggccga aaccgccgtg 661 gaggagccgg aggcgggtgt cgaagccgag cc

36、ggcgctcc agaccgtcga gcctgccgcg 721 gaggccgcat cggcggacgc cgcgccggca ccgcaggatg cgcaggccgg ggagccggtt 781 gccgagcctg ccgtcggcga ggcggccgac gccgaggctg ttgaacccgc cgcgaccgac 841 gccgaggaag ccgaggccgc ggaacccgaa accgtcgggg cagaggccga agcggccgtt 901 gcacccgaag ccgtgccggc gcccgtcccc gagcccgccc ccgagcccgc

37、tcccgccccg 961 gccgcggcga acgaggagcc ggcgcgtccc aagcgccgcg gctggtggtc catgggctga 1021 tctgtcgcag ccttccacga aagagtgacg ggcgcggggc tttcccgcgc cctttccatg 1081 agccaaggtg ccggacatgt tgggaatcga gcttgcagat gccgccttcc tgcccgccgc 1141 gacggtcgcg ctgctggccg ggatcctgtc tttcctgtcg ccttgcgtcc tgccggtggt 1201 g

38、cccccctat ctggcctata tgaccggggt cggcgtcggc gggctgaaat cgggcgaacg 1261 cagcgccgtg gttccggcgc tgttcttcgt cctggggctg tcgacggttt tcctgttgat 1321 gggcatggcg gcctcggcct ttggccggat gttcctgcaa tggcaggact ggctggcgcg 1381 cggggcggga gtggcggtca tcatcatggg cctgcacttc ctgcgcatca tccgcatccc 1441 cttcctggac accgag

39、gcgc ggctggatgc cggcgacaag ggcggctcct cgctgggagc 1501 ctatatcctg gggctggcct tcgcattcgg ctggacgccc tgcatcgggc cgcaactggg 1561 catgatcctg tcgctggccg tcaccggggc cgaggccggg cgcggcgcgg ccttgctggc 1621 cgtctatgcg ctggggctgg gcattccctt cctgctgtcg gcgatcttta tcaaccgcgc 1681 cattggcgtg atgaaccgca tcaagccgca

40、cctgaaactg atcgagcgca tgatgggcgg 1741 gcttttggtg gcggtcgggg cggcgctgct gaccggcgcc ttccccacct tcgcctattg 1801 gctgctggag acctttccct ggctggccac gctgggttag gcgcgggcgt cattcccagt 1861 tcggcggccg cttttccagg aaggcctgga tgccctcggc ggtatcgggc agcagcaggt 1921 tctcgcagat caccgcgcct gcggtctcat aggcatcggc gaggcccagg ttgcgctgtg 1981 cgtggaaggc acgcttgccc atgcgcacgg cggcgggcag cttggcggca atggtgcggg 2041 ccatcgccat cgcctcggcc tcaagcgcgg cgggcgggac gacgcgattc accaggccca 2101 gctcccgcgc ccggtcggcg tcgatgaact cgcccgtcac cagcagttcg aaggcggcgc 书号：155175327 定价： 18.00元